实验方法原理
| 硝酸还原酶（NR）催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对－氨基苯磺酸（或对－氨基苯磺胺）及α－萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。其反应如下： | |
| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 一、材料仪器设备及试剂 1. 材料：水稻或小麦的叶片、幼穗等。 2. 仪器设备：冷冻离心机；分光光度计；电子分析天平；冰箱；恒温水浴；研钵；剪刀；离心管；具塞试管；移液管；洗耳球。 3. 试剂及配制: 1μg·ml－1亚硝态氮标准母液配制：准确称取分析纯NaNO2 0.9857g，溶于蒸馏水后定容至1000ml，然后再吸取5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1μg·ml－1的标准液。 0.1mol·L－1pH7.5的磷酸缓冲液配制：称取Na2HPO4·12H2O 30.0905g与NaH2PO4·2H2O 2.4965g，加蒸馏水溶解后定容至1000ml。 1％对－氨基苯磺胺（W∕V）溶液配制：称取1.0g磺胺溶于100ml 3mol·L－1HCl中（25ml浓盐酸加蒸馏水定容至100ml即为3mol·L－1HCl）。 0.02％（W∕V）萘基乙烯胺溶液配制：称取 0.0200g萘基乙烯胺溶于100ml蒸馏水中，贮存于棕色瓶中。 0.1 mol·L－1KNO3溶液配制：称取 2.5275g KNO3溶于250ml 0.1mol·L－1pH7.5的磷酸缓冲液。 0.025 mol·L－1pH8.7的磷酸缓冲液配制：称取 8.8640g Na2HPO4·12H2O，0.0570g K2HPO4·3H2O溶于1000ml无离子水中。 提取缓冲液配制：称取 0.1211g半胱氨酸，0.0372gEDTA溶于100ml 0.025 mol·L－1pH8.7的磷酸缓冲液中。 2mg·ml－1NADH（辅酶Ⅰ）溶液配制： 4mg NADH溶于2ml 0.1mol·L－1pH7.5的磷酸缓冲液中（临用前配制）。 二、实验步骤 1. 亚硝态氮标准曲线制作 （1）取7支15ml刻度试管，编号，按下表配制含量为0－2.0μg的亚硝态氮标准液。 加入表中试剂后，摇匀，在25℃下保温30min，然后以0号管为空白对照，在520nm波长处测定吸光度（A）值 。 （2） 标准曲线绘制 以1～6号管亚硝态氮含量（μg）为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。 2. 样品中硝酸还原酶活力测定 （1） 酶的提取 称取0.5g鲜样，剪碎于研钵中置于低温冰箱冰冻30min，取出置冰浴中加少量石英砂及4ml提取缓冲液，研磨匀浆，转移于离心管中，在4℃，4000r/min下离心15min，上清液即为酶提取液。  （2） 酶促反应 取酶液0.4ml于10ml试管中，加入1.2ml 0.1 mol· L－1KNO3磷酸缓冲液和0.4ml NADH溶液，混匀，在25℃水浴中保温30min，对照不加NADH溶液，而以0.4ml 0.1mol·L－1pH7.5的磷酸缓冲液代替。 （3） 酶活性测定 保温结束后立即加入1ml 1﹪磺胺溶液终止酶反应，再加1ml 0.02﹪萘基乙烯胺溶液，显色15min后于4000 r / min下离心15min，以空白管为对照，取上清液在520nm波长处测定吸光度（A）值。 三、 酶活性计算 根据样品所测得的吸光度（A）值，从标准曲线查出反应液中亚硝态氮含量，按下公式计算样品中酶活性：  |
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