离子交换层析法分离氨基酸

实验概要

本实验介绍了离子交换柱层析法的基本操作技术，采用离子交换树脂分离了氨基酸。

实验原理

离子交换层析法主要是根据物质的解离性质的差异而选用不同的离子交换剂进行分离的方法。各种氨基酸分子的结构不同，在同一pH时与离子交换树脂的亲和力有差异，因此可依据亲和力从小到大的顺序被洗脱液洗脱下来，达到分离的效果。

主要试剂

苯乙烯磺酸钠型树脂(强酸1×8，100—200目)；2mol/L盐酸溶液；2mol/L氢氧化钠溶液。

标准氨基酸溶液：天冬氨酸、赖氨酸和组氨酸均配制成2mg/mL的0.1mol/L的盐酸溶液。

混合氨基酸溶液：将3种标准氨基酸溶液按1∶2.5∶10的比例混合。

柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液(pH5.8，钠离子浓度0.45mol/L)：取柠檬酸(C₆O₇H₈.H₂O)14.25g，氢氧化钠9.30g和浓盐酸5.25mL溶于少量水后，定容至500mL，冰箱保存。

显色剂：2g水合茚三酮溶于75mL乙二醇单甲醚中，加水至100mL。

主要设备

20cm×1cm层析管；恒压洗脱瓶；部分收集器；分光光度计。

实验步骤

1. 树脂的处理

将干的强酸型树脂用蒸馏水浸泡过夜，使之充分溶胀。用4倍体积的2mol/L的盐酸浸泡1小时，倾去清液，洗至中性。再用2mol/L的氢氧化钠处理，做法同上。最后用欲使用的缓冲液浸泡。

2. 装柱

取直径1cm，长度10-12cm的层析柱。将柱垂直至于铁架上。自顶部注入上述经处理的树脂悬浮液，关闭层析柱出口，待树脂沉降后，放出过量溶液，再加入一些树脂，至树脂沉降至8-10cm的高度即可。

3. 氨基酸的洗脱

用pH5.8的柠檬酸缓冲液冲洗平衡交换柱。调节流速为0.5mL/min，流出液达到床体积的4倍时即可上样。由柱上端仔细加入氨基酸的混合液0.25—0.5mL，同时开始收集流出液。当样品液弯月面靠近树脂顶端时，即刻加入0.5mL柠檬酸缓冲液冲洗加样品处。待缓冲液弯月面靠近树脂顶端时，再加入0.5mL缓冲液。如此重复两次，然后用滴管小心注入柠檬酸缓冲液(切勿搅动床面)，并将柱与洗脱瓶和部分收集器相连。开始用试管收集洗脱液，每管收集1mL，共收集60—80管。

4. 氨基酸的鉴定

向各管收集液中加1mL水合茚三酮显色剂并混匀，在沸水浴中准确加热15min后冷却至室温，再加入1.5mL的50%乙醇溶液。放置10分钟。以收集液第2管为空白，测定A570波长的光吸收值，以光吸收值为纵坐标，以洗脱液体积为横坐标绘制洗脱曲线。以已知3种氨基酸的纯溶液样品，按上述方法和条件分别操作，将得到的洗脱液曲线与混合氨基酸的洗脱曲线对照，可确定3个峰的大致位置及各峰为何种氨基酸。