离子交换柱层析法（层析实验简介）概略

一、    原理：

有些高分子物质含有一些可以分离的基因，例如-SO₃H，-COOH等，因此可以和溶液中的离子产生交换反应。如：

R-SO₃H＋M⁺ ———— R-S₃M＋H⁺

或R-NH₃OH＋CL^－  —————  R-NH₃CL＋OH^－

这类高分子物质通称离子交换剂，其中使用最普遍的是离子交换树脂。由于一定的离子交换剂对不同离子的亲和力不同，因此在洗提过程中，不同的离子在离子交换柱上的迁移速度也不同，最后得到分离。

二、    目的与要求：

本实验是采用Zerolit225型阳离子交换树脂所装的柱，选以特定的PH缓冲洗脱液来分离含有两个性质不同的氨基酸溶液。通过实验要求掌握装柱、上样、洗脱、收集等离子交换柱层析技术的要点。

三、仪器与装置：

玻璃层析柱：长475px，内径30px，3# 砂芯。

HL-2B型恒流泵。

HD-4型电脑核酸蛋白检测仪。

BS-100A自动部份收集器。

250ml烧杯。

1ml吸管。

水浴锅。

72型（或721型）分光光度计。

四、    试剂与药品：

树脂：Zerolit225型阳离子交换树脂。

洗脱液：0.45N，PH5.3柠檬酸缓冲液，取285g柠檬酸（C₆O₇H₈·H₂O）；186g 97℅NaOH；105ml浓硫酸溶于水中稀释至10升。

样品液：0.005M ASP和LYs的0.02N HCL混合溶液。

显色剂：显色剂列出两种可任选一种。

显色剂（Ⅰ）茚三酮-TiCL₃溶液。

10g茚三酮溶于500ml乙二醇甲醚，再加入0.85 ml TiCL₃（15%）

显色剂（Ⅱ）：茚三酮-KCN溶液。

0.1M KCN:0.1628g KCN溶于水中稀释至250ml

A、将1.25g茚三酮溶于25ml乙二醇甲醚，配成5%（W/V）浓度的溶液。

B、将2.5ml 0.01M KCN溶液与125ml乙醇甲醚混合。将A和B合并置棕色瓶中过夜即可使用。此溶剂用时，A、B两溶液在前一天合并，配好的溶液仅能在1-2天内使用，过时失效须重配。

五、方法与步骤：

1、树脂的处理：

关于市售新树脂的处理见7、，本实验采用处理好的树脂。

2、装柱：将层析柱垂直装好，关闭柱底出口，在柱内注入约25px高的柠檬酸缓冲液。

将经处理已成钠型的树脂置于烧杯中，加进1倍体积的柠檬酸缓冲液，搅成悬浮状沿柱内壁细心地把柱灌满。倒时不要太快，以免产生泡沫。待树脂在柱底逐渐沉积至约25px高时，用吸管吸去柱内上层所出现的清液，慢慢打开柱底出口，继续加注树脂悬液直至柱体装到200px高度为止。

在装柱时要避免使柱内液体流干而使装柱失败，另外树脂悬浮液的温度要相对恒定（特别是对于采用高温法）。装好的柱体应该没有纹路，没有节痕，没有气泡，柱顶表面平整而均匀。如此，方可投入使用，否则须要重装。

3、平衡：

柱装好后接上调好流速的恒流泵或恒压洗脱瓶，用柠檬酸缓冲洗脱液以24ml/hr的流速平衡，直到流出液的PH与洗脱液的PH相同为止，这大约需要2-3倍床体积。

4、加样与洗脱：

移去柱上加液器塞，打开柱底出口，小心使柱内液体流至体表面时即行关闭。用加样吸管吸取0.5ml氨基酸酸混合样品溶液。沿柱壁小心地加入柱中，加样不要过快，以免冲坏树脂表面，加样后慢慢打开柱底阀，使液面再与树脂面相齐时关闭，然后再用吸管吸取适量洗脱液，如此清洗柱内壁四周2-3次。洗涤后，用缓冲液在柱内加至2-75px高的液层，然后接上加液器，调好流速（24ml/hr）即开始洗脱。

注意在调节流速时要排除掉恒流泵或恒压瓶与柱之间连接管内的所有气泡。并且在调节时不要过猛，以免影响层析行为。

5、收集：柱流液可用自部分收集器约收20管。

6、测定：

将收集的各管编号后，分别取0.5ml收集液于一洁净的干试管中，加入1ml洗脱缓冲液；0.5mlKCN茚三酮试剂，混合后在100℃水浴加热25分钟，然后水冷却5-10分钟，加3ml 60%乙醇稀释，摇匀后用72型或721型分光光度计在570nm处比色。

测定后，以光吸收为纵坐标，收集的管数或ml数为横坐标绘制洗脱曲线。

7、再生：

对于装好的柱使用几次后需要0.2N NaOH溶液洗脱，再用蒸馏水洗至中性后重复使用。

对于市售的干树脂其处理方法为：先经水充分溶张后，倾泌去除细粒并使水澄清。然后经浮选得到颗粒大小合适的树脂，浮先后用4倍量的2N HCL和2N NaOH依次浸洗，每次半小时，换酸或碱时要用水将树脂洗至中性，最后树脂应处理至溶液无黄色。这时再用1N NaOH使树脂转成钠型（对于基它的转型要视实验和树脂的情形而定），以蒸馏水洗至中性备用。

对于不知或难以估计层析行为的样品层析时，要采用逐管收集测定跟踪法，以便掌握层析的结果。

氨基酸测定一般在1PH左右，在本实验中因缓冲液的PH就为5.3，因此可直接测定。但如果PH偏差要求太大，则可以加1ml、2N，PH5.5醋酸缓冲液，以保证测定条件。