离子交换法制备肝素实验

肠粘膜或猪肝

巴比妥缓冲液  阿拉伯胶   天青A   肝素      

烧杯  试管  试管架  玻棒 磁力搅拌器  电炉  吸滤瓶  布氏漏斗  离心机  722分光光度计   容量瓶   真空干燥器  真空泵  水浴锅  滤纸  布袋。精密pH试纸

溶液配制：

1. 巴比妥缓冲液(pH 8.6，0.05 mol/L)：称取1 g氢氧化钠溶于50 ml沸水  ，再精确称取二己基巴比妥酸5052  g溶于上述溶液中，冷却后稀释至500 ml，pH计校正到pH8.6。
 
2. 0.1%阿拉伯胶溶液：称取0.5 g，先用少量水分散，再稀释至500 ml，过滤备用。
 
3. 0.1%天青A溶液(称取0.5 g，先用少量水在研钵中研磨溶解，再稀释至500 ml，过滤，冰箱储备。用时再稀释5倍。
 
4. 肝素标准溶液：准确称取一定量的肝素标准品，用灭菌水配成100 U/ ml的标准溶液，冰箱暂放  ，用时以水稀释100倍。

操作步骤： 
 
1.提取（盐解法）

新鲜猪肠粘膜2 kg（或猪肝捣碎），加入氯化钠80 g（4%浓度），搅拌溶解后用40%氢氧化钠溶液调p H至9.0（用广泛pH试纸），水浴加热至50～55 ℃搅拌提取2 h，然后升温至90℃保持10 min，冷却至60 ℃用布袋过滤，取滤液待离子交换用。
 
2.离子交换

将滤液用水稀释3倍，加入D254树脂（氯型）120 g（按投料量6%，W/W），慢速搅拌6 h（可每隔1 h抽样测定提取液中剩余肝素的含量），过滤取树脂。
 
3.洗涤、洗脱

取离子交换后的树脂先用自来水洗净，而后用蒸馏水洗净。取洗净树脂加入等体积1.4 mol/L氯化钠溶液慢速搅拌1 h，过滤取树脂。继续用0.5倍体积的5 mol/L氯化钠溶液慢速搅拌2 h，过滤收集滤液（取样测含量）。树脂再加入0.5倍体积的3  mol/L氯化钠溶液，慢速搅拌1 h，过滤，滤液收集（取样测含量）。树脂再用0.5倍3 mol/L氯化钠溶液慢速搅拌2 h，过滤，滤液收集（取样测含量），合并三次洗脱滤液。
 
4.粗制肝素

取合并滤液加入1.5～2倍体积的95%乙醇洗一次，丙酮洗两次，真空干燥即得粗品肝素。
 
5.精制肝素

称取粗制肝素粉末用1%氯化钠溶液（预冷却）适量溶解，调pH1.8左右，离心15  min，上清液经砂心漏斗去除离心液表面的脂肪。悬液在水浴上加热至80～90 ℃，滴加0.0003 mol/L高锰酸钾溶液（按0.1～0.2 mol/亿单位），用滤纸法检测终点，滤液加入30%过氧化氢，调p H至11，放置36 h（冰箱内）。抽滤，滤液调pH至6.4，加入1倍体积的95%乙醇，离心，沉淀用95%乙醇洗二次，丙酮洗两次，真空干燥即得精制肝素。
 
6.天青法测定效价
 
（1）标准曲线的制作:取较大试管（易混匀）6支，以0～5编号，按下表操作。加入阿拉伯胶后必须摇匀方可加入染料，混匀后用722型分光光度计测505 nm处吸收值，以吸收值为纵坐标，单位数为横坐标绘制标准曲线。
 
（2）样品测定:精确称取样品约10 mg，先配成1 mg/ml溶液，再以2个100 ml容量瓶稀释为1 mg/100 ml溶液、2  mg/100 ml测定液，按下表操作并记录吸收值，分别从标准曲线上查出相应单位数，按下式计算样品效价，取平均值。




单位为U/ mg ，式中Pi 为由A 值在标准曲线上查出的单位数；V 为测定样品的总毫升数；Vi 为测定所用样品的毫升数；Sw 为称取样品的毫克数。