离子交换高效液相层析实验

实验材料 蛋白质

试剂、试剂盒 Tris·ClNaCl磷酸钠缓冲液

仪器、耗材 交换柱

实验步骤

1.  在使用IEX柱前，依次以序列溶液洗柱去除柱上吸附的蛋白质：10倍柱床的已脱气水和10倍柱床的高盐缓冲液，对聚合体IEX柱，洗柱液在8 ~10，对硅胶类柱，洗柱液pH在7~8。

2.  在室温平衡IEX柱，对4 mm 内径的柱子，以1.0 ml/min 的流速用0.2 mol/l，pH7.5的Tris·Cl缓冲液和Tris/NaCl缓冲液的50%混 合液洗20 min，然后用10倍柱床以上的0.2 mol/l，pH7.5的Tris·Cl缓冲液冲洗柱子，

3.  用210~220 nm 0.1~1.0 AUFS 监测空白的层析过程：0%~75%Tris/NaCl线性梯度20 min 以上，保持在75%缓冲液5 min，在5  min 以上的时间回复到0%。在下次上样前，保持0%缓冲液15 min。

4.  注射10 μl 0.2 mol/l Tris·Cl pH7.5进行一次空白样品的假层析。

5.  在5 000 g 离心IEX蛋白标准或多肽混合物5 min，用以0.2 mol/l Tris·Cl清洗过的HPLC进样器吸取5 μl 上清，加入样品环中，并注入柱子，按步骤3开始梯度洗脱。

6.  将每个层析峰收集干不同的聚丙烯管子，用反相HPLC脱盐，用Speedvac蒸发器除去溶剂。