禽流感病毒RNA的三种提取方法

实验概要

本实验介绍了禽流感病毒RNA的三种提取方法：异硫氰酸胍提取，TRIzol LS提取及Trizol法。

实验步骤

1. 用异硫氰酸胍提取

   1) 取200ul样品数 阴性对照 阳性对照个1.5ml灭菌eppendorf管。
   2) 加600ul异硫氰酸胍，然后加入对照和样品，再加200ul氯仿，颠倒混匀。
   3) 13000rpm离心15min。
   4) 在第3步离心快结束时，另取同样多eppendorf管，加入400ul -20度预冷的异丙醇。
   5) 取第3步离心的上清（一定不要吸取到中间白色层，第3步离心结束往外拿的时候，管子尽量不要倾斜）转移到第4步准备的管中，颠倒混匀。
   6) 13000rpm离心15min，轻轻倒去上清；在吸水纸上尽量沾干液体。
   7) 加600ul 75％乙醇，颠倒数次以洗涤残存异丙醇。
   8) 13000rpm离心15min，轻轻倒去上清；在吸水纸上尽量沾干液体。
   9) 4000rpm离心10sec，将管壁残存液体甩到底部，用微量枪头吸干，室温干燥2－3min（不可过分干燥，防止下一步RNA不溶解）。
   10) 加入20ul DEPE水(加入depc的纯水高压后的水即为DEPE水)，轻轻混匀溶解RNA。2000rpm离心5sec，冰上保存备用（最好2小时内使用，以免RNA降解）。

2. 用TRIzol LS提取

应用TRIzol LS提取病毒RNA

所提取物为血清、血液、细胞培养液、鸡胚尿囊液等液体中的病毒。提取时尽量在人少时进行，防止空气中RNA酶的污染。所用一切物品也应是无RNA酶的。
   1) 在1.5ml的eppendorf管中加入病毒原液500ul，再加入TRIzol LS 500ul，充分混匀，室温放置10min。
   2) 加入200ul的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管（溶液充分乳化，成乳白状，无分相现象），室温放置10min （由于氯仿沸点低、易挥发，振荡时离心管可能爆开，小心）。
   3) 离心 4℃、13000r/min、15min，取上层液相移入另一管（切忌吸动白色中间相）。 |
   4) 加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min。
   5) 离心 4℃、13000r/min、15min，（这时乍一看会发现管子里好像没有东西，再仔细看看，会发现靠近管底的壁上有一星点的白色沉淀物，就是它了）用枪小心吸去所有上清。
   6) 1ml75%乙醇洗一遍，离心 4℃、8000r/min、10min，（这时又会发现管子没东西了，不要担心，有的，但是因为量太少看不见罢了）用枪小心吸去所有上清，在超净台中干燥5min。
   7) 加入适量DEPC处理水。（如果材料来源丰富的话，加入的水量为下一步RT的total减去其他试剂的量；若要省着点用，则自己看着办了，尽量不要加太多的水）。
   8) 建议立即做RT。若要保存，可在上一步加入乙醇后冻存于－70℃，可保存一年；若加入DEPC水后则只能在－20℃保存1个月左右。

3. Trizol法提禽流感病毒
   1) 取鸡胚尿囊液，加入5-10倍体积 Trizol液，混匀；
   2) 室温放置5分钟，然后以每1ml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒；
   3) 取上层水相于一新的离心管，按每ml Trizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟；
   4) 弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，混匀，4℃下7500g离心5分钟；
   5) 重复第4步；
   6) 小心弃去上清液，然后室温干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度；
   7) 然后将RNA溶于水中，放置10分钟。

注意事项

1. 整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。
2. 加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。