第一代基因测序技术的原理

　　化学裂解法，其基本原理是特定化学试剂可对碱基进行特异性修饰，在修饰碱基处(5’或3’)打断磷酸二酯键将一个DNA片段的5’端磷酸基做放射性标记，再分别采用不同的化学方法修饰和裂解特定碱基，从而产生一系列长度不一而5’端被标记的DNA片段，这些以特定碱基结尾的片段通过凝胶电泳分离，再经放射自显影，确定各片段末端碱基，从而得出目的DNA序列。该方法能够检测双链DNA，但是其操作繁琐，程序复杂，被同时期的Sanger双脱氧链终止法取代[2]。

　　双脱氧链末端终止法，其原理是将2’,3’-双脱氧核苷酸(ddNTP)参入到新合成的DNA链中，由于参入的ddNTP缺乏3’-羟基，因此不能与下一位核苷酸反应形成磷酸二酯键，DNA合成反应将终止。测序时分成四个反应，每个反应中加入DNA聚合酶、待测模板、引物、四种脱氧核糖三磷酸(dNTPs)，除此之外还要加入一种双脱氧核苷三磷酸(ddNTPs)，然后进行反应，ddNTPs随机取代相应的dNTPs，由于其3位的羟基变成了氢，不能继续延伸，使正在延伸的寡聚核苷酸选择性的在A、T、C或G处终止。终止的核苷酸由相应的ddNTPs决定，通过电泳可分离出长度不同的片段，再对这些片段的末端碱基进行检测从而获得所测片段的碱基序列。

　　最初对凝胶片段末端碱基的检测是用同位素标记法，20世纪80年代，用荧光进行标记，可自动测序，到20世纪90年代，随着毛细管电泳技术以及微阵列毛细管电泳技术的发展，测序的通量得到大幅度提高。

　　双脱氧链末端终止法的优点有：

　　1)可用于未知或已知突变的检测，更容易实行；

　　2)假条带的出现减少，结果更加清楚；

　　3)读取的长度也较长；

　　4)因为掺入了同位素标记的三磷酸，末端终止法可以测更小序列的核苷酸链；

　　5)基本适用于所有的突变类型，准确率几乎100%，在单基因病的基因诊断和产前诊断中仍广泛使用。

　　双脱氧末端终止法的缺点：

　　1)离不开PCR扩增，且只能分析单个的DNA片段，通量小，不能进行基因组层面的分析；

　　2)自动化程度低，检测速度慢，对于某些需要快速检测的疾病不适合；

　　3)双脱氧链末端终止法成本高，不适用于大规模测序。