类器官荧光染色实验流程（一）

固定

注意: 合并2-3孔的几十个类器官最为理想，但也可只使用一个孔的类器官。

使用PFA固定和O.C.T包埋的实验流程

使用1.5 mL的EP管收集类器官，使用4% PFA溶液室温固定半小时。室温下用PBS清洗3次，每次5分钟。然后将样本转移至30% 蔗糖溶液4度孵育过夜。第二天，移除蔗糖溶液，在O.C.T中孵育15分钟。将类器官转移至组织模具中，置于-20度，继续在O.C.T中进行包埋。可于-80度储存或进行冷冻切片。

使用福尔马林固定和琼脂糖包埋的实验流程

1. 从孔板中吸出培养基。加入1 mL的福尔马林。

2. 使用1 mL的枪头轻柔地重悬类器官和基质胶，将混合物转移至EP管中。将所需的所有孔的类器官加入同一EP管中。（也可以在孔板中进行固定，一起重悬）

3. 轻轻混合，放在冰上孵育至少一个小时。

4. 4度，1500 rpm，离心5分钟。

5. 小心地吸出福尔马林。

6. 用冰冷的PBS清洗，4度，1500 rpm，离心5分钟，小心吸出PBS。重复至少两次。（为了帮助去除Matrigel，也可加入Cell recovery medium，冰上孵育15-30分钟）

7. 使用冷的福尔马林重悬将类器官，4度孵育过夜。

注意：染色方面，类器官切片的处理方式与其他组织切片一样，使用一般脱蜡，补液，抗原修复等的常规步骤。

hPSC-Derived Intestinal Organoid, EPCAM (Green), KRT20 (Red), Desmin (White), DAPI (Blue)

8. 准备模具：准备1条8-strip PCR管，分成单个管，切掉管的下半部分，得到一个圆环作为模具。将模具放到培养皿中，使其与底部平齐，然后放在冰上。

9. 使用福尔马林轻柔的混合类器官，4度，1500 rpm离心5分钟。轻轻吸出福尔马林，不要接触到沉淀的类器官。如果观测到成块的基质胶，可使用BD cell recovery medium冰上孵育30分钟。再次离心，尽量吸出所有的液体。

10. 使用无菌的PBS配制3% 低融点的琼脂糖。使用微波炉加热至完全融化。

11. 趁琼脂糖溶液还保持温热的液体状态时，使用75 µL的琼脂糖液体轻柔地重悬类器官。如果使用 200 µL或更小的枪头，剪掉枪头尾部，防止损伤类器官。

12. 立即将重悬后的类器官和琼脂糖液体转移入冰上放置的培养皿中的模具中。琼脂糖会立即固化。第11步和第12步一定要完成的越快越好（15秒以内），否则琼脂糖会在枪头中固化，造成样本的损失。避免引入气泡，但少量的气泡可能无法避免。

13. 在倒置显微镜检查琼脂糖包埋的类器官的数量，质量和位置。

14. 在4度孵育1个小时以上，确保琼脂糖固化完成。

15. 从模具中取出，转移到组织盒中，使用70% 乙醇储存。

hPSC-Derived Hindgut Spheroid, EPCAM (Green), CDX2 (Red), E-Cad (white), DAPI (Blue)

补液，抗原修复和染色

补液（Rehydration）

1. 把切片放入接近沸腾的热水中加热11分钟。（切片应放入切片盒内，且保持干燥。）

2. 使用组织级别的二甲苯里清洗2分钟。重复4遍。

3. 使用100% 乙醇清洗5分钟。重复2遍。

4. 使用90% 乙醇清洗5分钟。

5. 使用70% 乙醇里清洗5分钟。

6. 使用dH2O清洗5分钟。

注意：

- 免疫荧光染色（Immunofluorescent staining ），请继续进行第7-18 步

- H&E 染色（H&E staining ），请继续进行第19-24步

- 阿尔新蓝染色（ Alcian Blue staining），请继续进行第25-32步。

抗原修复

7. 将切片放入密封的切片盒中。使用微波炉将柠檬酸盐缓冲液（10 mM 柠檬酸钠，0.05% tween-20，pH 6.0）加热至沸腾。用缓冲液加满切片盒，没过所有的切片。

8. 将放有切片的切片盒和缓冲液置于蒸器中30分钟。（需要保持温度接近沸点，而不要到达沸点。）

9. 将切片从柠檬酸钠缓冲液中取出，短暂降温，然后用PBS缓冲液清洗2分钟。