精准医学时代免疫微环境分子分型及免疫治疗耐药机制

　　免疫治疗是晚期实体瘤治疗的重要手段之一。经过几十年的长足发展，历经了肿瘤细胞因子治疗[包含白介素、干扰素、胸腺法新（即胸腺肽α1）等]、肿瘤疫苗治疗、细胞免疫治疗以及免疫检查点治疗几个阶段。近年来，肿瘤免疫治疗取得了重大进展，《科学》杂志将肿瘤免疫治疗列为“2013年十大科学突破”首位，尤其以PD-1/PD-L1负性检查点为代表的单克隆抗体，在晚期实体瘤治疗中取得巨大成功。截至目前为止，已有Pembrolizumab（PD-1单抗）和Nivolumab（PD-1单抗）获FDA批准用于治疗恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌及头颈部肿瘤，Atezolizumab（PD-L1单抗）、Durvalumab（PD-L1单抗）均获批用于治疗泌尿系上皮肿瘤、非小细胞肺癌等瘤种。同时，在全球范围内，还有数千个免疫治疗相关的临床研究正如火如荼地开展。免疫治疗正改变着恶性肿瘤的治疗策略。但不可否认的是，单药PD-1/PD-L1单抗治疗的有效率仍然较低。例如，针对非选择性人群，单药PD-1单抗在晚期非小细胞肺癌的客观有效率为19-22%，在晚期恶性黑色素瘤中为25-35%，在晚期肾癌患者中约为25%，而在晚期头颈部鳞癌及肝癌中则分别为14%、15%左右。因此，如何进一步筛选优势人群，或针对特定人群优化免疫联合策略，是在精准医学时代背景下亟需回答的问题，也是现阶段免疫治疗研究的一大热点。

　　目前，FDA已批准两个免疫治疗相关靶标用于优势人群筛选：一是PD-L1表达丰度，利用免疫组化技术，对微环境中肿瘤细胞及浸润性免疫细胞的PD-L1表达水平进行检测，主要应用于晚期非小细胞肺癌及胃癌的PD-1单抗靶标预测；另一个是错配修复蛋白及微卫星不稳定（Mismatch repair/microsatellite instability，MMR/MSI）的检测。2017年一项全球多中心单臂临床研究数据显示，在149例MSI-H/dMMR的泛瘤种患者中，Pembrolizumab的客观有效率达39.6%。基于该数据，FDA批准Pembrolizumab用于晚期实体瘤合并MSI-H/dMMR的患者的二线治疗。然而，在临床实际应用当中，这两个靶标仍然存在诸多瓶颈。首先，dMMR在多数晚期实体瘤中发生率较低，例如，在晚期结直肠癌中发生率为5-8%，晚期胃癌中为3-5%，而晚期肺癌中仅不到2%，这导致了该靶标获益人群的局限；另外，有研究结果显示，即使在PD-L1强阳性（超过50%肿瘤细胞阳性）的晚期非小细胞肺癌患者中，PD-1单抗（作为一线治疗）的客观有效率为44.2%；在PD-L1阳性（超过1%肿瘤细胞阳性）的晚期胃癌三线治疗中，有效率仅为22.2%。也就是说，即使经过PD-L1的阳性选择，PD-1单抗仍对一大部分患者无效。因此，想要突破上述瓶颈，进一步细化免疫分型、深入研究耐药机制则是当下至关紧要的任务。

　　1、细化微环境的免疫分型。大量循证医学证据证实，切实有效的分子分型是指导精准治疗的基础。肿瘤微环境涉及要素众多、关系复杂，肿瘤细胞得以摆脱免疫系统的监控识别、逃离T细胞的杀伤，离不开诸多要素的共同作用：如成纤维细胞和巨噬细胞从抑制生长状态被肿瘤细胞驯化为促瘤状态（如TAMs分泌大量的蛋白酶、细胞因子和生长因子促进肿瘤生长）；MDSCs和Treg扰乱DCs抗原递呈，抑制T细胞和B细胞增殖活化和NK细胞的毒杀作用，干扰肿瘤微环境的免疫平衡；另外，静息状态下，多数肿瘤细胞在蛋白水平不表达或低表达PD-L1，仅当效应性T细胞浸润至肿瘤组织、释放IFN-γ并作用于肿瘤细胞后，才通过一系列的分子信号途径诱导PD-L1表达上调，进而介导获得性免疫耐受的发生。因此，肿瘤微环境中，对免疫治疗产生显着影响的核心要素是：1.特异性杀伤T细胞的浸润丰度；2.依赖于IFN-γ通路的PD-L1表达情况，以及各种活化性分子的下调表达、抑制性分子上调表达；3.各种抑制性T细胞的活化及清除。

　　陈列平教授团队2012年即提出，联合检测肿瘤浸润性淋巴细胞（Tumor Infiltrating Lymphocyte，TIL）及肿瘤微环境中的PD-L1，能够优化对PD-1单抗的疗效预测。基于这两个指标，可以将肿瘤患者初步分为四个亚型：Type I：获得性免疫耐受型（TIL+， PD-L1+），这种类型理论上是免疫治疗，特别是PD-1/PD-L1抑制剂起效的理想分型；Type II：免疫无反应型（TIL-， PD-L1-），这种类型是预后最差的一种分型，通常需要采用多种策略的联合治疗来诱发患者的免疫反应；Type III：原发诱导表达型（TIL-， PD-L1+），该类型临床少见，各个瘤种不一致，PD-L1表达不依赖于经典的IFN-γ途径，往往通过原癌基因的活化导致PD-L1的固有表达，前期研究表明这种类型往往对PD-1/PD-L1抑制剂的疗效不敏感；Type IV：其他通道逃逸型（TIL+， PD-L1-），针对这一类型目前临床应用讨论很不一致，其牵涉到PD-L1的的时间空间异质性，理论上，该肿瘤的免疫逃逸是依赖于其他的抑制性分子产生，需要今后更多的免疫检查点通路抑制剂的临床验证。

　　尽管该分型实现了免疫细胞及分子层面的进一步细化，但仍然存在一些问题迫切需要解决：第一，PD-L1蛋白表达的时间、空间的抑制性以及各个公司采用的抗体并不一致，导致目前PD-L1检测存在分歧。例如，Pembrolizumab采用22C3伴随检测抗体，Nivolumab采用28-8作为伴随检测抗体，Atezolizumab采用SP142作为伴随检测抗体，而Durvalumab采用SP263作为伴随检测抗体，临床上各种针对PD-L1检测的解读铺天盖地，非肿瘤专科医生往往很难甄别，目前在肺癌领域，正在发起多中心的病理协作，制定以及比对各个抗体之间的特异性以及敏感性差异，解决临床现今检测的瓶颈；第二，针对TIL细胞的分类需要进一步细化，而不同类型的TIL浸润对预后指导意义大不相同；第三，针对TIL的计数评分常采用主观的二级半定量评分，可重复性不高，不同中心、不同病理师的阅片判读结果不容易达成一致；第四，常规方法难以满足肿瘤微环境分析的要求，如：蛋白印记和流式细胞学的方法丢失了肿瘤的形态信息；分子水平的检测（一代、二代测序、qPCR）能够分辨出足够多的基因型或细胞型组分，但无法判断这些组分在组织原位的空间位置关系，而这种定位关系对理解其在微环境中的作用又是至关重要的；常规免疫组化方法无法分辨足够多的细胞表型。综合以上，目前迫切需要开发出针对肿瘤微环境的多分子标记景观分析系统，同时建立每个分子的标准化检测流程，满足目前临床对免疫微环境的关键分子标记物需要定位、定量、定性分析的需求，同时还必须满足可重复性。例如，目前人工智能在数字化病理上探索应用，以及目前免疫评分体系在肠癌、肺癌以及乳腺癌的初步建立，都是对目前肿瘤免疫微环境分型的一个极大推动。

　　2、原发耐药的机制探索。免疫治疗原发耐药包含肿瘤细胞本身固有因素以及肿瘤细胞外部因素。固有因素包括：异常基因突变频率及总突变负荷；肿瘤抗原表达的缺失；原癌基因活化（EGFR、KRAS、MAPK，PI3K、WNT等）导致PD-L1的固有表达；肿瘤本身缺乏有效的抗原呈递系统；肿瘤本身缺乏主要组织相容性复合体（MHC）的表达；IFN-γ信号途径的异常突变导致肿瘤对杀伤性T细胞的不敏感等（见图1）。而外部因素包括：肿瘤微环境中缺乏杀伤性T细胞浸润； CTLA-4和其他免疫检查点的异常活化；T细胞衰竭和表型变化；免疫抑制性细胞群（Treg，MDSC，II型巨噬细胞）以及肿瘤微环境中细胞因子和代谢产物释放（CSF-1，色氨酸代谢物 ，TGF-β，腺苷）对免疫微环境产生的抑制效应（见图2）。

　　对于上述复杂过程，如何发现、干预并深入挖掘其机制，是现阶段巨大的挑战。需要基础医学、转化医学以及临床医生的深入合作探索。通常目前认为，免疫治疗各个环节的多策略联合治疗是逆转耐药的有效方法，如化疗、放疗与PD-1/PD-L1抑制剂的联合使用，特别是局部放射治疗逆转耐药目前已经有诸多研究报道；肿瘤新抗原疫苗不仅可以协同PD-1/PD-L1增效，同时有逆转其耐药的理论基础；不同免疫检查点抑制剂的联合治疗，比如CTLA-4联合PD-1/PD-L1抑制剂，目前已有成熟的报道，而IDO抑制剂、OX40激动剂等正在进行临床研究；抗血管生成联合免疫治疗也有大量的临床研究正在开展；另外从机制上看，胸腺法新可以增强肿瘤抗原提呈作用，同时还可以促进肿瘤细胞表面MHC的表达，从而增强T细胞对肿瘤细胞的识别，改变肿瘤微环境，从而在一定程度上逆转耐药。有临床前的动物模型研究表明，PD-1抗体联合胸腺法新对荷瘤小鼠肝细胞癌皮下移植瘤有一定的协同作用，胸腺法新可能增强PD-1抗体的肿瘤抑制作用。

　　此外，对肿瘤、血液及其他样品采取基线和动态分析模式，可以帮助我们为现阶段及今后的深入研究作好准备。肿瘤微环境的基线评估通常包含对血液或组织样本的总突变负荷、驱动基因突变情况以及多基因表达的综合分析，也包括对CD8+T细胞的PD-L1、TCR表达情况及克隆能力的分析。而在治疗前后（治疗前、治疗早期和进展时间点）对新鲜连续人类标本（肿瘤，血液，血清和微生物组）进行纵向动态评价，则有可能通过深度分析揭示治疗抗性的潜在机制（见图3）。这种基线和动态的分析方法超越了对静态时间点的常规分析，并能通过动态评估癌症应答寻找优异的预测性生物标志物。因此，它将成为临床及转化基础研究中，深入揭示免疫检查点抑制剂反应及耐药机制的重要手段。