糖蛋白糖基化

　　已上市的蛋白药物中，治疗性糖蛋白药物数量众多，糖基化是最常见的蛋白翻译后修饰。2020版《中国药典》第一增补版中，正式发布9405糖蛋白的糖基化分析指导原则。赛默飞能为糖基化分析提供业内最全方案，可根据糖蛋白的复杂性、与药物安全有效的相关性以及生产监控策略的总体设计等，为糖基化提供完整糖蛋白、糖肽、寡糖、单糖的全面分析。

　　一级结构分析：糖型分析

　　糖基化对蛋白药物的疗效、稳定性、免疫原性具有重要的影响。以单克隆抗体为例，如果出现N-糖型以外的糖型，则会影响免疫原性或半衰期，需要避免；另一方面，可以细胞工程及分子生物学技术，提高一些N-糖型的含量，以增强ADCC、CDC、Anti-inflammatory等效能。寡糖为非模板合成，并呈树状结构，其结构极其复杂，仅由6种单糖组成的寡糖链，其理论结构即达到惊人的1012种。这就要求用于寡糖的分析设备具有强悍的分析性能。赛默飞开发了一系列简单、高效的液相色谱-质谱表征方法，涵盖了从糖链结构分析、到糖基化位点鉴定、再到糖肽解析的完整分析流程。

　　寡糖链分析

单克隆抗体N-糖链 (a) LC-MS/MS完整分析流程, (b) IC-MS分析流程

ED安培检测器和MS检测N-糖型结果

　　使用赛默飞Vanguish Horizon UHPLC-FLD对人血清lgG和商业嵌合lgG1单抗(英夫利西单抗)中的n-聚糖进行释放、标记、分离和基于外糖苷酶的结构解析，并使用Q Exactive Plus超高分辨质谱仪对结构进行确认，实现快速和明确的分析。

在 Accucore 150-Amide-HILIC 上用不同长度的柱子对人血清 IgG 2-AB 标记的N-聚糖进行色谱分离

　　离子色谱无需衍生，定量准确，可以覆盖分析所有糖类型，N-糖基化修饰的糖链可以通过肽糖苷酶Ｆ或肽糖苷酶Ａ酶切作用，或者肼解作用从糖蛋白上释放出来。糖链经净化后可直接进样，无需衍生，避免了衍生化过程中唾液酸化聚糖的结构改变。

使用 Accucore 150-Amide-HILIC 色谱柱和 Q Exactive Plus 质谱仪对人 IgG 中 2-AB 标记的 N-聚糖进行结构鉴定

　　离子色谱还可以和高分辨质谱联用，实现对色谱峰的鉴别。以Q Exactive为代表的Orbitrap超高分辨率质谱对未标记的糖具有高灵敏度，可解析糖链结构。安培检测器、高分辨质谱和离子色谱联用，可同时解决糖链的定性和定量分析。

Ofatumamab的N糖图谱

　　糖基化位点分析

　　糖基化位点的发现与确证对质谱的分辨率与灵敏度具有较高要求。Orbitrap由于具有超高分辨率和超高灵敏度，无论对于单抗等纯蛋白样品、还是全细胞蛋白等复杂样品，都是是糖基化位点表征的最佳工具。目前糖基化位点最大的数据集，共从小鼠组织与血浆中注释了6367个糖基化位点。该实验采用用PNGase F释放糖链并标记18O方法，使用Orbitrap鉴定糖基化位点，共鉴定到6367个位13点，其中5753个位点是没有记载的新位点。该研究对糖蛋白糖基化的研究具有重要意义，也展示出了Orbitrap超群的性能。在相对简单的抗体及其他蛋白药物糖基化位点表征中，Orbitrap 更可毫无疑问地胜任此工作。

　　对于糖结构和糖基化位点信息分析，Orbitrap Eclipse三合一质谱仪拥有CID, HCD, ETD HD, EThcD HD, ETciD, UVPD, PTCR等多种碎裂模式，而且还具有高达50万的分辨率，能够对多种形式的修饰肽段进行精准定性与定量，为研究者提供了更坚实的硬件基础。

新冠病毒S蛋白上符合“O-Follow-N”规律的O糖基化修饰