红细胞免疫功能的检测方法

实验概要

人及多种动物红细胞与白细胞一样，也具有重要的免疫功能。其基础是红细胞表面具有C3b受体(C3bR)。红细胞可通过其表面的C3bR，发挥清除免疫复合物(IC)、促进吞噬、提呈抗原及激活补体等多种作用。因此，建立的检测红细胞免疫功能的各种方法，也多以红细胞表面的C3bR为基础设计的。现已建立的方法主要有标准红细胞免疫粘附试验、红细胞SPA混合花环试验、单克隆抗体Coombs试验、抗C3bR单克隆抗体法、酶联免疫吸附试验、放射配体结合法、红细胞促吞噬作用测定法等。本实验介绍了简便易行的红细胞C3bR酵母花环试验及红细胞IC酵母花环试验。

实验原理

红细胞C3bR酵母花环试验用于测定红细胞C3bR，其原理为用小鼠等血清(补体)致敏后的酵母，其细胞表面吸附有C3b，可与红细胞表面的C3bR结合，从而将酵母细胞吸附在红细胞周围形成花环。红细胞IC酵母花环试验用于检测红细胞表面的免疫复合物，其原理为红细胞表面的C3bR可与体内形成的抗原-抗体-补体复合物中的补体成分结合，而将免疫复合物吸附在其表面，而酵母细胞也可与免疫复合物中的补体成分结合，从而被吸附于红细胞表面形成花环。通过检测该两种花环率的高低，即可测知红细胞免疫功能状态。

主要试剂

酵母试剂、Hanks液、豚鼠血清、动物抗凝血、姬氏染色液等。

主要设备

离心机、恒温水浴箱、显微镜、计数器、小离心管、血细胞计数板等。

实验步骤

1. 红细胞C3bR酵母花环试验

   1) C3b致敏酵母悬液制备：将酵母试剂用Hanks液(含钙、镁，pH值7.2，下同)洗1次(1000 r/min 10min)，配成含1×10⁸酵母细胞/ml的悬液，然后加等量新鲜豚鼠血清，混匀，37℃水浴20min，然后再以Hanks液洗2次，恢复原浓度，即为C3b致敏酵母细胞悬液。酵母试剂用Hanks液洗涤后，配成1×10⁸/ml浓度，即为非致敏酵母悬液。

   2) 红细胞悬液制备：将人或鼠、兔、牛、鸡等被检动物的肝素抗凝血，用Hanks液洗3次(每次以2000 r/min离心5min)，最后将红细胞用Hanks液稀释成1.25×10⁷细胞/ml的悬液。

   3) 检测方法：取C3b致敏酵母悬液和红细胞悬液各50μl，混匀，于37℃水浴40min后取出，轻轻摇起，加0.25%戊二醛溶液20μl固定5min，用适量Hanks液稀释，涂片，干燥，甲醇固定，姬姆萨氏染液染色，高倍镜检查，以1个红细胞粘附2个或2个以上酵母细胞为1个花环，计数200个红细胞，求出花环率。

2. 红细胞IC酵母花环试验除酵母细胞不致敏外，其余同红细胞C3bR花环试验。

3. 结果

正常情况下，两个试验均会看到在红细胞周围粘附几个酵母细胞形成的花环，且红细胞C3bR花环率大大高于红细胞IC酵母花环率。如正常情况下，人的两种花环率分别为25%～35%和3～8%，鸡的两种花环率分别为9%～19%和3%～6%。但发生疾病时(如各种传染病及肿瘤等)，两种花环率会发生变化。

注意事项

1. 不同动物来源的补体对本实验结果影响很大，因此检测不同种属来源的红细胞，应采用不同动物的补体。如检测人的红细胞，应用豚鼠血清作补体，检测鸡的红细胞应以家兔血清作补体，检测牛的红细胞应以小鼠血清作补体。补体来源不对，很难形成花环。

2. 补体血清及被检红细胞均应现采现用，不能马上使用时，可暂存于4℃冰箱内，但一般不超过6h。

3. 试验管从水浴中取出摇匀时，要以腕力轻轻摇匀，不可振荡。涂片时，应用毛细管吸一小滴于玻片上，并用平放的毛细管轻轻涂开即可，不可来回反复涂抹。

4. 所用Hanks液pH值要调整准确，否则不易形成花环。