红豆杉的组织培养

红豆杉属于裸子植物，主要分布于我国的云南、四川、西藏和东北，是一类具有重要开发价值的树木，它产生的紫杉醇通过临床实验被认为是最有希望的抗癌药物。自然状态下，紫杉醇的含量极低，仅占树皮干重的十万分之一，靠自然资源解决这一问题十分困难。

同时由于自然状态下红豆杉生长速度很慢，过量的人工采伐，使野生资源受到了极大的破坏，在一些产地已面临灭顶之灾，保护其野生资源和扩大药源已成为当前急需解决的矛盾。

用播种育苗和扦插繁殖虽可在一定程度上缓解矛盾，但仍无法满足需求，也不能从根本上解决问题。利用植物组织培养和细胞培养的方法来解决资源和药源的矛盾，已成为国内外学者关注的问题。

（一）材料

较为适宜的组培外植体为新生的嫩枝，取材时间以每年的7、8月份为宜。

（二）培养程序

1、愈伤组织诱导用培养基

培养基的基本成分采用B5或MS的微量元素、有机物和铁盐，外加KNO3 2500mg/L,NH4NO3 825mg/L KH2PO4 、240mg/L,MgSO4·7H2O 370mg/L,CaCl2·2H2O660mg/L。

添加的激素种类及数量为NAA 0.8-1.0mg/L、 BA0.3-0.5mg/L，调PH值为5.8-6.0；琼脂粉和蔗糖用量分别为5.6-6.0g/L和30g/L。配置好的培养基用培养瓶分装，经高温、高压灭菌后备用。

2、材料消毒与接种

取新生的嫩枝（带有针叶）放入加有0.02%洗洁精的自来水中浸泡10分钟，浸泡过程中需经常搅动，浸泡结束后用自来水冲洗10分钟以上。将嫩枝转入一干净的三角瓶中。

以下所有操作必须在超净工作台上进行无菌操作。首先往三角瓶中加入75%的酒精，加入量应为嫩枝体积的10倍以上，浸泡杀菌30-60秒，倒掉酒精，用无菌蒸馏水年漂洗一次；再将嫩枝转入事先已高压消毒的三角瓶中，加入15倍与嫩枝体积的0.1%的升汞溶液，浸泡杀菌5-8分钟，浸泡过程中要不断摇动，以使升汞与嫩枝充分接触。

为了达到彻底杀菌的效果，有人建议在升汞溶液中加入0.02%的表面活性剂，这样可能更好一些，但要相对缩短杀菌时间。倒掉升汞溶液，用无菌蒸馏水冲洗4-6次，每次1-2分钟，以彻底除去升汞。

将嫩枝从三角瓶中分批取出，用无菌滤纸吸去材料表面的水分，将嫩枝切成0.5-0.8CM的小段，并切取部分针叶，嫩枝切段和针叶同时用作外植体，接种在诱导愈伤组织的培养基上。接种时要让针叶的腹面接触培养基，嫩枝的植物学近地端接触培养基。

注意用过的升汞溶液和冲洗液不要到处乱倒，以防重金属污染。

将接种好的培养物放置于培养室中培养，温度（25±2）℃，光照强度1500-2000lx，光照时间10h/d。

3、愈伤组织诱导

红豆杉嫩枝和针叶在培养基上2-3周后即开始形成愈伤组织，约4-5周愈伤组织直径可达1-2CM。

不同种的红豆杉和不同的外植体之间形成愈伤组织的比率、时间早晚和生长速度存在明显差异，南方红豆杉和东北红豆杉的嫩枝切段出愈较快，出愈率分别为89%和70%，针叶出愈较慢，出愈率也较低，分别为36%和15%；普通红豆杉出愈较慢但出愈率较高，嫩枝和针叶的出愈率分别为94%和30%。

愈伤组织开始时为灰白色，随着愈伤组织的增大，先期形成的愈伤组织颜色由灰白色变为棕色，这可能预示着愈伤组织在逐渐发生褐变，因此要及时给予注意，尽量保持较低的培养温度和经常更换培养基。当愈伤组织生长到一定大小时即可转入液体进行悬浮培养。

4、细胞悬浮培养与继代

利用愈伤组织而不是用小苗或大树来生产提取紫杉醇，是一条正在探索的途径，如果成功则可以实现工厂化生产，从根本上解决红豆杉资源不足的矛盾。

因此，通过嫩枝和针叶培养产生的愈伤组织不需要进行芽分化的诱导，而是将愈伤组织直接转入细胞悬浮培养。

具体做法是将从嫩枝和针叶上产生的愈伤组织取下来直接转入液体培养基中进行（悬浮）振荡培养，所用培养基与上述诱导培养基相同。在初次将愈伤转到液体培养基即可适当加入少量纤维素酶和果胶酶，以加快愈伤组织分离成单个细胞或小细胞团。

在初次悬浮培养阶段可用50ml的小三角瓶，每瓶加10ml液体培养基，放入愈伤组织，在20-23℃的摇床上振荡培养，光照条件与普通培养相同。每周需要更换一次培养基，更换时用5-10ml的平头移液管将三角瓶中的愈伤组织、单个细胞或细胞团过滤出来，直接转到新鲜的培养基中即可。

在悬浮培养过程中应随时注意每一瓶中愈伤组织、细胞团生长的情况，挑选生长速度最快和特征最好的作为继代的材料，毫不可惜的丢掉那些不好的（生长缓慢、颜色不正等）材料，这样经过几代的选择，就可以挑出符合理想的材料，作为悬浮系进行扩增培养。

（三）紫杉醇含量的检测

现行的比较普遍有效的方法是利用薄层层析法，其大体过程是先将愈伤组织干燥，再用甲醇渗滤提取，获得提取液，经减压浓缩至干，用水：CHCl3取。

合并CHCl3部分，再经减压浓缩获得粗提液，经薄层层析，收取喊紫杉醇和10-脱乙酰基巴卡丁-III的部分，再进行硅胶柱层析，分离收集相应流分，减压浓缩，TLC再次检测，将含有紫杉醇的浓缩液进行二次柱层析，鉴定结果。

另外，红豆杉愈伤组织经过一定分离提取后，可进行高效液相色谱层析（HPLC）分析，分析柱为4mm*250mm的C18柱，dp=10μm，分离体系为甲醇-乙腈-水（20：33：47）等速洗脱，流速为1ml/min。

关于红豆杉植物组织细胞培养中褐化的问题是当前存在的一个重要问题，该现象与普通木本植物组培中出现的褐变不同。普通木本植物出现的褐变可通过选用较小的外植体、培养基中加活性炭、缩短继代转移周期、尽量少损伤外植体等措施加以克服，且以后不再发生。

但是，利用上述方法解决红豆杉的褐化问题收效甚微，这或许是因为紫杉醇本身对细胞生长具有毒害作用，其量的积累往往对细胞的增殖起抑制作用。如何解决提高细胞内紫杉醇的含量而又不给细胞的生长带来很大影响，使二者相协调一致，是急需研究的课题。