纯化非肌肉肌球蛋白实验

细胞

缓冲盐溶液 二异丙基氟瞬酸 匀浆缓冲液

相差显微镜

1. 准备下面的贮液和材料。

等渗的缓冲盐溶液（例如 PBS，150 mmol/L NaCl；10 mmol/L NaPO₄，pH 7.2)

二异丙基氟瞬酸（DIFP）

1 mol/L 咪唑-HCl，pH 7.0

0.5 mmol/L K⁺EGTA，pH 7.0

0.1 mol/L K⁺ATP，pH 7.0

0.1 mol/L DTT

NaN₃

蛋白酶抑制剂

PMSF

抑胃酶肽 A

亮抑酶肽

刀豆胰蛋白酶抑制剂

匀浆缓冲液：

0.34 mol/L 蔗糖

20 mmol/L 咪唑-HCl，pH 7.0

5 mmoI/L K⁺EGTA，pH 7.0

5 mmol/L K⁺ATP，pH 7.0

5 mmol/L DTT ( 干粉或用贮存液）

50 μmol/L PMSF

3 mmol/L NaN₃

22 μmol/L 抑胃酶肽 A

1.2 μmol/L 亮抑酶酞

10 μmol/L 刀豆胰蛋白酶抑制剂

PMSF 可以用 pAPMSF 代替，它更稳定，但更贵。

2. 洗细胞：轻轻地沉降细胞（例如 3000 g 离心 5 分钟），去掉培养基，通过振摇打碎沉淀物，然后重悬于至少 10 倍体积冰冷的等渗缓冲盐水中。再次在新鲜的等渗缓冲盐水中沉降和重悬，总共 3 次。对于不同的细胞类型，离心力和时间应该进行优化。

3. 最终的冰冷的细胞悬液中补加 DIFP，使终浓度为 5.7 mmol/L（每毫升细胞悬液中加 1 μl）。冰浴 5 分钟。

4. 上述的步骤 2 沉降细胞，然后重悬于 4~6 倍匀浆缓冲液中。

5. 细胞匀浆要造成最大破坏，但要尽量减少氧化。

6. 用相差显微镜检测细胞的裂解，证实超过 99% 都已经裂解了。