纯化的RNA的点杂交和狭线杂交

实验方法原理 点杂交和狭线杂交技术（Kafatos et al. 1979) 用于在同一固相支持物（通常为带电荷的尼龙膜）上固定几种核酸样品，然后用合适的探针与已固定的样品杂交，并由此判断靶序列的浓度。通过估计样品点发射出 的信号的强度，与已知浓度的标准品信号强度 进行比较，确定待测样品中靶序列的量。

实验材料 RNA 检测样品、标准品和阴性对照探针标记与变性

试剂、试剂盒 NaOH预杂交液RNA 变性液SSC

仪器、耗材 印迹装置绞链仪带正电荷尼龙膜厚印透纸水浴锅

实验步骤

一、材料

1. 缓冲液与溶液

NaOH ( 10 mol/L)

预杂交液

RNA 变性液

0.1X SSC ( 含 0.1% SDS，m/V)

0.1X SSC ( 含 1%SDS，m/V)

0.5X SSC ( 含 0.1% SDS，m/V)

1X SSC ( 含 0.1% SDS，m/V)

2X SSC

20X SSC

2. 核酸与寡聚核甘酸

RNA 检测样品、标准品和阴性对照

3. 探针

探针标记与变性

4. 专用设备

印迹装置

绞链仪（如 Stratalinker, Stratagene; GS Gene Linker, Bio-rad) 或真空炉、微波炉

带正电荷尼龙膜

厚印透纸（如 Whatman 3 MM, Schleicher&Schuell GB004, 或 Sigma QuickDraw)

预热水浴锅到 68℃

二、方法

安装印迹装置

1. 切一张合适大小的带正电荷尼龙膜。用铅笔标上表示方向的记号。用水把膜简单弄湿，在 20X SSC 中室温泡 1 h。

2. 在膜浸泡期间，先用 0.1 mol/L NaOH 小心清洗印迹装置，再用无菌水洗干净。

3. 把两片厚滤纸用 20X SSC 浸湿，再放到真空器顶部。

4. 把样品槽插入装置的上部，把湿尼龙膜放在样品槽加样孔的底部，用吸管在膜的表面滚动以去除膜与装置夹层中的气泡。

5. 加紧夹板，连接真空管。

6. 加入 10X SSC 直至液面没过尼龙膜，关掉真空，再用 10X SSC 充满。

RNA 样品准备

7. 把每个 RNA 样品（溶解在 10 μl 水）分别与 30 μl RNA 变性液混合。

8. 65℃ 温育 5 min，然后在冰上冷却。

9. 向每个样品中加入等体积 20X SSC。

10. 轻轻向印迹装置中吸入 10XSSC，直到淹没尼龙膜。

RNA 样品的印迹和 RNA 在膜上的固定

11. 把所有样品轻轻加入狭线中，然后轻轻吸干膜。当所有样品都铺到膜上后，每个狭线用 1 ml 10XSSC 洗两次。

12. 当第二次洗膜完成后，继续轻轻吸干膜。

13. 取下膜，然后用紫外交联、烘烤或微波照射把 RNA 固定在膜上。

固定化 RNA 的杂交与洗膜

14. 把膜放入烤盘或杂交炉中，加入 10~20 ml 预杂交液 68℃ 温育 2 h。

15. 把已变性的放射性标记的探针直接加到预杂交液中。在适当的温度下继续温育 12~16 h。

16. 杂交完后从塑料袋中取出膜，然后尽可能快地把膜转移到室温下装有 100~200 mJ、1X SSC ( 0.1% SDS) 的塑料容器中。盖紧塑料容器，放到摇床上轻摇 10 min。

17. 把膜转移到另一个装有 100~200 ml 的、预热到 68℃ 的 0.5X SSC ( 含 0.1% SDS) 的塑料袋中，然后在此温度下轻摇 10 min。

18. 按步骤 17 重复洗膜两次，使总的洗膜次数达到三次。

19. 用滤纸吸干膜，在 -70℃ 条件下放射自显影 24~48 h ( Kodak XAR-5 或相当的胶片)。钨酸盐型的增感屏比旧式稀土型的效果更好。当然，磷光成像仪也可以用来成像。