组织病理实验（一）

实验方法原理 石蜡切片是最基本的切片技术，冰冻切片和超薄切片等都是在石蜡切片基础上发展起来的。苏木素与伊红对比染色法（简称H.E.对染法）是组织切片最常用的染色方法。这种方法适用范围广泛，对组织细胞的各种成分都可着色，便于全面观察组织构造，而且适用于各种固定液固定的材料，染色后不易褪色可长期保存。

实验材料 小鼠

试剂、试剂盒 中性福尔马林固定液酒精二甲苯石蜡蜂蜡苏木精染液伊红酒精溶液盐酸酒精溶液甘油蛋白粘片剂中性树胶卡诺固定液

仪器、耗材 切片机恒温箱蜡杯酒精灯解剖剪培养皿镊子单面刀片包埋盒染色缸盖玻片载玻片玻片盘显微镜温度计水浴锅

实验步骤

一、材料准备：

1.  中性甲醛固定液：

甲醛（37%-40%，市售，本所购买即为此浓度）100 mL

磷酸氢二钠6.5 g

磷酸二氢钾（钠）4 g

双蒸水900 mL

2.  1%盐酸乙醇液：

盐酸1份

70%酒精100份

3.  甘油蛋白贴片剂：

蛋白50 ml

甘油50 ml

水杨酸钠（防腐剂）1 g

4.  配制

（1）将鸡蛋一个打破入碗或杯中，去蛋黄留下蛋白，用玻棒调打成雪花状泡沫。

（2）然后用粗纸或双层纱布过滤到量筒中，经数小时或一夜，即可滤出透明蛋白液。

（3）此时在其中再加等量的甘油，稍稍振摇使两者混合。

（4）最后加入防腐剂（水杨酸钠）作防腐用。可保存几个月。

二、实验步骤：

1.  取材

（1）颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剪取肝组织（或其他组织）。

（2）切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以5 mm×5 mm×2 mm或10 mm×10 mm×2 mm 为宜。

（3）取下所需要的肝组织，切成一小块2~3 mm 厚。

2.  固定

（1）将切好的肝组织用生理盐水组织洗一下

（2）立即投入中性福尔马林固定液中固定

（3）固定30~50 min。

3.  洗涤

材料经固定后，流水冲洗，数小时或过夜。

4.  脱水

（1）材料依次经70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水，各30 min。

（2）再放入95%、100%各2次，每次20 min。

5.  透明

（1）纯酒精、二甲苯等量混合液15 min，二甲苯Ⅰ15 min、Ⅱ15 min（至透明为止）。

（2）由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。

（3）当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。

6.  透蜡

（1）放入二甲苯和石蜡各半的混合液15 min，再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡各50~60分钟。

（2）透蜡的目的是除去组织中的透明剂（如二甲苯等），使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以便包埋。透蜡时间根据组织大小而定。

（3）透蜡应在恒温箱内进行，并保持箱内温度在55~60℃左右，注意温度不要过高，以免组织发脆。一般置于恒温箱0.5 h。

7.  包埋

（1）包埋时，用镊子夹取石蜡模子（金属质地）在酒精灯上稍加热，放在平的桌面上。

（2）从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入少许石蜡。

（3）再将镊子在酒精灯上稍加热，夹取材料将切面朝下放入蜡模中，排列整齐。

（4）再放上包埋盒，轻轻倒入熔蜡。

8.  切片

（1）将已固定和修好的石蜡块装在切片机的夹物台上。

（2）将切片刀固定在刀夹上，刀口向上。

（3）摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口。

（4）调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15度左右。

（5）调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般为4~10微米。

（6）一切调整好后主可以开始切片。此时右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度不可太急，通常以40~50 r/min。

（7）切成的蜡带到20~30 cm 长时，右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起，以免卷曲，并牵引成带，平放在蜡带盒上，靠刀面的一面较光滑，朝下，较皱的一面朝上。

（8）用单面刀片切取蜡片一小段，放在载玻上加水一滴，置于放大镜或显微镜下观察切片是否良好。

（9）切片工作结束后，应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡，把切片机擦拭干净妥为保存。