细胞中分子之间动态相互作用的光学成像

克服动态分辨率限制

由Würzburg大学的Markus Sauer教授(Rudolf Virchow中心和生物中心)和Gerti Beliu博士(Rudolf Virchow中心)的研究小组开发的新的光开关指纹分析使光学成像与细胞中其他分子的动态相互作用。“到目前为止，还没有一种方法能够可靠地在10纳米以下的细胞中实现结构光学分辨率。通过阐明这一屏障的潜在原因，结合新的直接标记方法，我们首次成功地实现了几纳米的细胞分辨率。这一进展使得分子功能和细胞重要成分的结构得以揭示。”Sauer报告说。

单分子定位显微镜方法，如由Markus Sauer教授团队开发的dSTORM，可以在10-20纳米范围内实现分辨率。结合结构化照明方法，染料的定位精度可达1纳米。不幸的是，这种高定位精度无法转化为细胞中几纳米的空间分辨率。

问题在于:目前的标记方法，例如用抗体进行免疫染色，会造成超过10纳米的间距误差。因此，标记分子的大小阻碍了纳米级的分辨率。导致10纳米以下分辨率障碍的其他原因之前是未知的。“在我们的出版物中，我们现在首次表明，由于染料之间的各种能量转移过程，染料在开和关状态之间的光开关率(闪烁)在10纳米以下的距离受到强烈影响。这就导致了在实验的前几秒钟内，与染料的快速光漂白相关的群集状态，这使得它们的单个定位更加困难，”Sauer解释道。“因此，染料定位概率的降低导致了较差的结构分辨率，而不是基于单个定位精度的预期。这类似于管弦乐队，所有的乐器在乐曲的开始同时演奏;要分辨出单个的音轨是不可能的。”

荧光强度迹线

然而，光开关指纹和荧光衰减时间也包含存在的染料数量的信息，由于能量传递的距离依赖性，也包含它们之间的距离的信息，而不能够光学分辨单个染料。通过基因编码扩展，然后用小荧光染料进行生物正交点击标记，将非自然氨基酸合并到多聚膜受体中，Würzburg研究小组现在能够在下一步展示如何实现细胞中蛋白质的特定位点特异性标记，而不存在低于10纳米距离的间距误差。Beliu说:“通过分析质膜中多聚体受体的光开关指纹，我们第一次能够估计细胞中5-7纳米范围内受体亚基之间的距离，并确定标记亚基的数量。”

想象并理解分子间的交流

在下一步，研究团队打算优化光开关指纹分析，并将其与单分子定位显微镜结合使用，使用模式激励方案和DNA-PAINT在10 nm以下分辨率的细胞中进行可靠的超分辨率成像。这将为细胞结构、细胞器和多蛋白复合体的分子组织以及利用光学方法对蛋白质结构的结构阐明提供新的见解。

这种新开发的方法不仅为感染、脂质和癌症研究的分子机制提供了独特的见解:光开关指纹也有可能更真实地表示神经系统中受体的动态和复杂性，这些受体对神经元突触的信号转导很重要。神经元之间的相互作用决定了我们日常的学习和记忆过程。Beliu在描述这些研究发现的意义时说:“因此，理解这个分子乐团是如何组装和发挥作用的，从根本上来说是非常重要的。”