细胞和亚细胞提取物的制备实验

实验方法原理 对于细胞内蛋白的纯化和特性分析，重要的是选择一种有效的方法来破碎细胞或组织，使蛋白迅速地从胞内相对隔离的空间中释放到缓冲液中，而该缓冲液应对所研究的蛋白的生物活性没有影响。广泛使用的破碎软组织的方法之一是勻浆。

在本方案中，讨论了使用机械力匀浆组织：在 Potter-Elvehjemglass-Teflon 勻浆器 (见图 3.1)、Dourxce 手动勾装器或便携式韦林揽切器（Hand-heldWaringBlender) 中切碎组织的三种程序。这些方法快速、安全，且蛋白酶从其他的细胞区隔中释放出来的风险很小。可以通过在匀浆缓冲液中加人蛋白酶抑制剂来降低蛋白酶的水解作用。

实验材料 合适的动物组织

试剂、试剂盒 二硫苏糖醇匀浆缓冲液A匀浆缓冲液B苯甲基磺酰氟

仪器、耗材 离心机粗棉布和过滤漏斗 切刀或绞肉机匀浆均化器

实验步骤

要点：所有操作均在 0~4°C 进行。

1.从动物中取出组织后，修剪并去除脂类和结缔组织，然后放入预冷的匀浆缓冲液 A 中。

2.用切刀把洗好的组织切成小块（如 1cm 方块），或者把这些组织放在绞肉机上搅两次。

像肝脏、大脑、肾和心脏等组织很容易在韦林搅切器中破碎，但是骨骼肌和肺则很难，所以应在勻浆之前先用家用绞肉机来绞碎。许多纤维组织，比如哺乳动物胸腺，必须在匀浆之前冰冻以利于破碎（常用 Ultra-Turrex 勻浆器）。培养的哺乳动物细胞和少量的软组织（1~5 g)，比如脑，可以使用 Dunce 手动勻架器（Dignam,1990) 来勻浆。在所有情况下，都要 4°C 预冷匀浆器和玻璃容器，并且匀浆操作应该在冷室中进行。

3.将组织加入 3~4 倍体积的匀浆缓冲液 B 中，然后转移到匀浆器中。

4.使用下面的方法来制备匀浆液。

Potter-Elvehjem 勻浆器：仪器设置在 500~1500r/min，勻浆组织数次，每次 5~10s。

Dounce 手动匀浆器：匀浆组织 10~20 次。

韦林搅切器：匀浆组织 3~4 次，每次 20~30s，间隔 10~15s。

5.把匀浆液倒入玻璃烧杯，把烧杯放在冰上，在 4°C 条件下温和搅动匀浆液 30~60 min，以便充分提取蛋白。

实验提示：匀浆过程中不要起泡。

6.4°C 条件下 10000g 离心 10~20 min，除去匀浆液中的细胞碎片和其他物质。

7.过滤漏斗中铺两层纱布（或加一层玻璃棉）来过滤上清，除去漂浮在表面的脂类物质。小心地拧纱布以便获得最大量的滤液（称为「粗提液」）。

8.尽快用适当的分离方法和分析方法处理样品。