细胞传代实验

实验方法原理 培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。贴壁生长的细胞用消化法传代；部分贴壁生长的细胞用直接吹打可传代；悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打传代。

实验材料 细胞

试剂、试剂盒 D-Hanks液小牛血清RPMI1640双抗胰蛋白酶EDTANHClNaHCO3

仪器、耗材 净化工作台离心机恒温水浴箱冰箱倒置相差显微镜培养箱吸管玻璃瓶培养瓶废液缸吸头枪头胶塞离心管量加样枪 红血球计数板

实验步骤

1.  贴壁细胞的消化法传代：

（1）吸除或倒掉瓶内旧培养液。

（2）D-Hanks液洗2～3次。

（3）向瓶内加入适量消化液（胰蛋白酶或与EDTA混合液）轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面。

（4）然后吸掉或倒掉消化液后再加适量新的消化液，轻轻摇动再倒掉大部分消化液，仅留少许进行消化（也可不采用上述步骤直接加消化液进行消化）。

（5）消化最好在37℃或室温25℃以上环境下进行。

（6）消化2～5 min 后把培养瓶放置显微镜下进行观察，发现胞质回缩，细胞间隙增大后，应立即终止消化。

（7）吸除或倒掉消化液，如用EDTA消化，需加Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶把残留消化液冲掉。

（8）再加培养液。如仅用胰蛋白酶可直接加少许含血清的培养液，终止消化。

（9）用弯头吸管，吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，吹打过程要顺序进行。

（10）从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有底部都被吹到，使细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔不要用力过猛。 

（11） 计数，分别接种在新的培养瓶内。

2.  悬浮细胞的传代：悬浮细胞传代可离心收集细胞后传代，或直接传代。

离心传代法：

（1） 将细胞连同培养液一并转移到15 ml 离心管内。

（2） 离心800~1000 rpm，5 min。

（3） 弃去上清，加新的培养液到离心管内，用吸管吹打形成细胞悬液。

（4） 计数，分别接种在新的培养瓶内。

（5）直接传代即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清液吸掉1/2~2/3，然后用吸管吹打形成细胞悬液后再传代。

3.  部分贴壁细胞的传代

（1）部分贴壁不牢的细胞，如Hela细胞等，不经消化处理直接吹打可使细胞从壁上脱落下来，而进行传代。

（2）对绝大部分贴壁生长的细胞，因直接吹打对细胞损伤较大，细胞常有较大数量的丢失，因而需消化后，才能吹打传代。

注意事项

1.  胰蛋白酶要预温，温度37℃左右为宜℃。

2.  离心转速要合适，转速过低，不能有效分离细胞，离心速度过大，时间过长，会挤压细胞造成损伤甚至死亡。

3.  要定时观察细胞，发现污染，应及时处理。