一、细胞冻存 1. 细胞悬液制备 选对数生长期细胞,10 ml 培养瓶面,几乎成单层时可冻存一管;收集细胞24 小时前换液一次;按传代方法制成细胞悬液。 2. 收集细胞 将细胞悬液移入无菌离心管中,1000 rpm,离心5 分钟,去上清。 3. 冻存液 将培养液和甘油按9:1 的比例配成10%的冻存液,取1~1.5 ml 到离心管中,轻轻吹打使细胞悬混。 4. 装瓶 用吸管吸取细胞悬液1.5 ml,装入安瓶中,尽量不使液体碰到安瓶口。 5. 封口 将安瓶在火焰最热处封好,如用冻存管将盖儿拧紧即可。 6. 标记 用记号笔记好细胞名称,冻存年月日。 7. 冻结和保存 将安瓶装在纱布袋中,置4 ℃ 2~4 小时,-20 ℃ 2~4 小时,液氮的气相部分-130 ℃~-180 ℃,浸入液氮。液氮量一定要充分,以使温度恒定。 二、细胞复苏 1. 用大镊子取出液氮中的安瓶,投入盛有37~42 ℃的水中,不时摇动,使之快速通过-5~0 ℃。 2. 在超净台中,用砂轮擦安瓶颈并用酒精棉球消毒,打开安瓶,吸出细胞悬液装入培养瓶中,并以10×稀释,放CO2 培养箱中进行培养,第二天换新鲜培养液,以换掉冻存剂。 展开 |