细胞的冻存

实验方法原理 已长满的细胞经胰蛋白酶处理后，重悬于冻存液中。两种试剂即甘油和 DMSO 是常用的细胞保护剂，它们在细胞保存液中起到防止细胞内冰晶形成的目的。血清的浓度经常增加至 20%。

实验步骤

1) 吸干已长满细胞的细胞瓶内培养液。

细胞不应在高密度状态下冻存，并应在冻存的 24 小时内换液。

2) 加 2 ml 胰蛋白酶（T-25 细胞培养瓶）处理细胞。

3) 让液体在细胞表面来回流动 4~5 次。

4) 吸干胰蛋白酶液。

5) 重复步骤 3 和 4。

6) 置 37°C 3~5 分钟。

7) 将细胞从细胞培养瓶表面洗下，重悬细胞于 3~5 ml 培养液中。

8) 离心，200 g，5 分钟；重悬沉淀于 1 ml 冻存液中。

冻存液

细胞生长培养液（RPMI,DMEM 等）    7 ml

FBS                                                            2 ml

甘油或 DMSO                                           1ml

小心：甘油；DMSO

甘油或 DMSO 的浓度介于 5%~20% 之间。生长培养液的体积应调整以适于所用细胞保护剂的变化。

如果欲冻存悬浮细胞，沉淀 5x106~10x106 对数生长期细胞，重悬沉淀于 1 ml 冻存液中。

9) 加入 1 ml 细胞（单层细胞约为 3x106~5x106; 悬浮细胞约为 5x106~10x106) 于

冻存管上标明细胞系的名称、日期和生长培养液。

10) 置冻存管于 Nalgene 细胞冻存器中，并让细胞冻存管在-80°C 过夜或利用可控速率的冷冻装置。

11) 次口，将冻存管转移至液氮中。此步骤操作宜迅速，冻存液不应融化。