细胞凋亡的免疫检测技术1

一、概述

细胞凋亡（apoptosis,Apo）是细胞增殖的反面，探讨的是细胞死亡的方式与机制。凋亡一词来源于希腊语。原指花瓣、叶片的脱落。自1972年Kerr首次提出细胞凋亡的概念以来，随着细胞生物学、免疫学和肿瘤学的研究发展，最近几年人们对细胞凋亡的重大理论意义和实际意义有了更深的理解。细胞凋亡是指在一定的生理和病理情况下，机体为维护内环境的稳定，通过基因调控而使细胞自动消亡的过程。不同类型的细胞，在发生凋亡时的动力学过程也不一致，存在着一定的形态学和生物化学的差异，但若干基本变化是大同小异的。其特征为：整个胞体呈浓缩状，有特异性胞浆大泡，胞质、核质深染，核碎裂后被细胞膜包裹而形成凋亡小体（apoptosis body）。它有别于细胞死亡（necrosis,Nec）。在琼脂糖凝胶电泳上显示出特殊的DNA梯状图谱。它的出现主要是由于一种钙-镁依赖性核酸内切酶激活后，裂解染色质核小体（nucleosome）之间的连接DNA，将核小体切割成 180bp～200bp或其倍数的片段所致。Apo是不可逆的过程，散在分布于组织中，形成的凋亡小体，除核裂解外，外有膜包绕，内有完整的细胞器，凋亡小体在组织中很快被邻近组织细胞吞噬，并在溶酶体中被降解。因此，Apo不引起周围组织炎症及损伤。Apo是机体自己启动，由细胞本身主动控制，由基因指导的细胞自我消亡过程。因此，又称程序性细胞死亡（programmed cell death,PCD）。
光镜下，Apo的典型形态学特征是核染色质广泛凝聚，细胞体积缩小，胞质浓缩，有凋亡小体存在，细胞表面特化结构如微绒毛等丢失及细胞表面明显的迂曲。体内细胞凋亡过程发展非常迅速，细胞常在数小时内完成Apo并降解，凋亡细胞仅出现数分钟就消失，故不适宜应用形态学方法（普通光学显微镜检测法、荧光显微镜检测法、凋亡小体的电镜观察及凋亡指数和细胞活力的定量测定）来检测。在生物化学方面，利用电泳技术证明核体断片的“DNA梯状图谱”作为检测群体细胞发生凋亡的一个指标。经过人们多年的研究发现，应用原位末端转移酶标记技术（TDT assay or TUNEL reaction）来检测细胞凋亡，其灵敏度高，特异性强，能早期显示未发生典型变化的凋亡细胞。它是检测单个细胞早期出现凋亡现象的好方法。近几年，人们又发现了能更快、更敏感、检测细胞数量更多的并能从更多方面证明凋亡和坏死的流式细胞分析术（flow cytometry，FCM 包括亚“G1”峰检测法和末端转移酶标记技术）等。本章仅介绍免疫学检测方法。

二、ELISA法

（一） 原理
细胞凋亡的发生，是由于钙-镁依赖性核酸酶进入核小体间切割DNA,产生180bp～200bp或其倍数的核小体片段。而核小体由于与组蛋白 H2A、H2B、H3和H4形成紧密复合物而不被核酸内切酶切割。采用双抗体夹心酶免疫法，应用小鼠抗DNA和抗组蛋白的单克隆抗体，与核小体片段形成夹心结构，可特异性检测细胞溶解物中的核小体片段。
（二）材料与试剂
1．采用 Boehringer Mannheim公司试剂盒，生物标记的小鼠抗组蛋白单克隆抗
体。
2．过氧化物酶（-POD）标记的小鼠抗DNA单克隆抗体
3．链霉亲合素包被的微孔板
4．DNA－组蛋白复合物，作为阴性对照。
5．ABTS底物
6．溶解缓冲液
7．温育缓冲液
8．底物缓冲液
（三）样品
1．培养细胞或离体细胞的裂解物 细胞裂解步骤：收集细胞，离心后，用200µl溶细胞缓冲液重新悬浮，室温下作用30min。
2．培养细胞的上清液
3．血浆（血清）
（四）操作方法

1．取样品离心后（1 000r/min,10min）,吸取20µl上清液，加入链霉亲合素包被的培养板孔中。
2．另加入80µl免疫反应试剂 含抗－DNA－POD、抗组蛋白－生物素及温育缓冲液（按1︰1︰18混合），室温下孵育2h（置摇床上，250r/min）。
3．取上清，用300µl温育缓冲液洗涤3次，小心移去洗涤液。
4．加入100µl底物缓冲液，室温下孵育使颜色变化至适合（置摇床上）。
5．尽快作比色分析（10min～20min内），用底物缓冲液作空白对照，以波长405nm，参考波长 492nm进行检测。

（五）结果判定

按下列公式计算细胞释放的单/低聚核小体片段的特别聚集值：

注：mU= 吸收值（10-3）=双孔吸收值的平均OD值－底物OD值，若样品的吸
收值超过比色测定范围，应适当稀释后再检测。
三、原位末端转移酶标记技术

（一）原理
凋亡细胞是由于内源性核酸内切酶的激活后，将DNA切割成许多双链DNA片段以及高分子量DNA单链断裂点（缺口），暴露出大量3-羟基末端，如用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）将标记的dUTP进行缺口末端标记，则可原位特异地显示出凋亡细胞。主要应用的是荧光标记法和酶标记法。