细胞凋亡晚期检测技术

  晚期检测：

    细胞凋亡晚期中，核酸内切酶（某些Caspase的底物）在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在180-200 bp 。对于这一现象的检测通常有以下两种方法：

    1.TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling）

    通过DNA末端转移酶将带标记的 dNTP （多为dUTP）间接或直接接到3’-OH端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。美国Intergen公司提供多种标记方法，直接荧光标记，介导荧光标记或过氧化物酶联显色，可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。其中，直接标记步骤少，操作简便。而间接标记有信号放大的作用，检测灵敏度高。

    2.LM-PCR Ladder （连接介导的PCR检测）

    当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化。CLONTECH公司的ApoAlert?LM-PCR Ladder Assay Kit通过LM-PCR（ligation-mediated PCR）,连上特异性接头，专一性地扩增核小体的梯度片段，从而灵敏地检测凋亡时产生的核小体的梯度片段。此外，LM-PCR 检测是半定量的，因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。

    上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核DNA断裂这一特征，但细胞受到其它损伤（如机械损伤，紫外线等）也会产生这一现象，因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰。

    3.emerase Detection （端粒酶检测）

    这是相对来说推出较早，用得较多的一种方法。端粒酶是由RNA和蛋白组成的核蛋白，它可以自身RNA为模板逆转录合成端粒区重复序列，使细胞获得“永生化"。正常体细胞是没有端粒酶活性的，每分裂一次，染色体的端粒会缩短，这可能作为有丝分裂的一种时钟，表明细胞年龄、复制衰老或细胞凋亡的信号。研究发现，90%以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活性。Intergen公司的TRAP-eze emerase Detection Kit在1996年推出。它提供特定的寡核苷酸底物，分别与底物及端粒重复序列配对的引物。如果待测样本中含有端粒酶活性，就能在底物上接上不同个数的6碱基（GGTTAG）端粒重复序列，通过PCR反应，产物电泳检测就可观察到相差六个碱基的DNA Ladder现象（参见图4）。此外，Intergen公司还提供用酶联免疫法（ELISA）检测的试剂盒.