一、试剂与仪器 1. 孵育缓冲液：10 mmol/L HEPES/NaOH，pH7.4，140 mmol/L NaCl，5 mmol/L CaCl2。 2. 标记液：将FITC- Annexin V（宝灵曼公司产品）和PI加入到孵育缓冲液中，终浓度均为1 ug/ml。 3. 流式细胞仪。 二、实验步骤 1. 细胞收集：悬浮细胞直接收集到10 ml的离心管中，每样本细胞数为（1~5）×106/mL 500~1 000 r/min离心5 min，弃去培养液。 2. 用孵育缓冲液洗涤1次，500~1 000 r/min离心5 min。 3. 用100 ul的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10~15 min。 4. 500~1 000 r/min离心5 min沉淀细胞孵育缓冲液洗1次。 5. 加入荧光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20 min，避光并不时振动。 6. 流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用488 nm，用一波长为515 nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560 nm的滤器检测PI。 7. 结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。 展开 | 