细胞凋亡检测实验——AnnexinVFITC单染法

Annexin V-FITC

标记缓冲液PBS去离子水冰块

移液器吸头微量离心管可调速离心机载玻片盖玻片流式细胞仪或荧光显微镜

1.  凋亡细胞的制备

小鼠腹腔注射地塞米松25 mg/kg体重，10 h后解剖取胸腺，分离胸腺细胞。用PBS洗两遍，调整待测细胞的浓度为2×10⁶ /ml，备用。
 

2.  200 μl细胞悬液加入1 ml冷PBS，轻轻震荡使细胞悬浮，1000 rpm 4 ℃离心10 分钟，弃上清。
 

3.  重复步骤2两次。
 

4.  将细胞重悬于200 μl 标记缓冲液。
 

5.  加入10 μl Annexin V-FITC，轻轻混匀，避光室温反应15 分钟或4 ℃反应30 分钟。
 

6.  加入300 μl标记缓冲液，立即上机（流式细胞仪）检测。

1.  整个操作过程动作要尽量轻柔，切勿用力吹打细胞，尽量在4 ℃下操作。

2.  反应完毕后要尽快检测，因为细胞凋亡是一个动态的过程，反应一小时后荧光强度就开始衰变。
 

3.  Annexin V-FITC是光敏物质，在操作时要注意避光。




 

一、实验结果

用荧光显微镜观察，凋亡细胞细胞膜上可见黄绿色光环。PS转移到细胞膜外不是调亡所特有的，也可发生在细胞坏死中。以FITC标记的Annexin V, 可以同时结合使用PI（碘化丙啶）拒染法，用流式细胞仪分析可检测凋亡细胞的百分率。