细胞分离纯化技术

淋巴细胞分离液 血清 肝素

肝素 Hank's液 PBS

滴管 吸管 针头 碘酒 酒精 棉球 止血带 计数板 显微镜 离心机

1.  在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。

　　
2.  取肝素抗凝静脉血与等量Hank's液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000 rpm×20 分钟。

　　
3.  离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank's液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。

　　
4.  用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入5 倍以上体积的Hank's液或RPMI1640，1500 rpm×10 分钟，洗涤细胞两次。

　　
5.  末次离心后，弃上清，加入含有10 ％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2 ％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。

　　　　　　　　　                                 4个大方格内细胞总数

单个核细胞浓度（细胞数/1 毫升细胞悬液）＝────────×10⁴×2（稀释倍数）

                                                                               4

　　
6.  细胞活力检测

死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百分率。

　　　　　　   活细胞数

活细胞百分率＝──────　×100 ％

　　　　　　　总细胞数
 

用本法分离PBMC，纯度在90 ％以上，收获率可达80～90 ％，活细胞百分率在90 ％以上。　

1.  抽取人外周静脉血时要注意无菌操作。

　　
2.  操作全程应尽可能短时间内完成，以免增加死细胞数。

　　
3.  用淋巴细胞分离液分离PBMC时，离心机转速的增加和减少要均匀、平稳，使保持清晰的界面。

　　
4.  小鼠、兔等动物淋巴细胞比重与人不同，配制相应密度的Percoll或不同比例的聚蔗糖和泛影葡胺。

一、附录

1.  Hank's液（无Ca^2＋、Mg^2＋）配制法

NaCl 8.0 克，KCl 0.4 克，Na₂HPO₄·12H₂O 0.12 克，KH₂HPO₄0.06 克，葡萄糖1.0 克，双蒸水1000 毫克，1％酚红液2 毫克

　　
将上列成分混合后溶化，分装于500 毫升盐水瓶内，8 磅15 分钟灭菌，4 ℃冰箱保存，临用时调PH至7.3～7.6。

　　
2.  细胞分层液配制法

9 ％聚蔗糖24 份，34 ％泛影葡胺10 ％

　　
混合，测比重为1.077～1.078，G5玻璃滤器过滤除菌。4 ℃冰箱保存备用。

　　
3.  磷酸缓冲液（PB）

原液

A液

0.2 M NaH₂PO₄溶液，NaH₂PO₄ 27.6 克，或NaH₂PO₄·2H₂O 31.2 克，蒸馏水，溶解至1000 毫升

　　
B液

0.2 M Ha₂HPO₄溶液，Ha₂HPO₄·12H₂O 71.6 克，蒸馏水溶解至1000 毫升　

各种不同PH值PB的配法

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　PH　　　　7.0    7.2    7.4    7.6   7.8   8.0

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A液（ml）     39.0  28.0  19.0  13.0  8.5  5.5

B液（ml）     61.0  72.0  81.0  87.0 91.0 94.5

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举例
0.1 M 　PH7.2PB

A液28 毫升，B液72 毫升，加蒸馏水100 ml

　　
4.  血球保存液

　
葡萄糖2.05 克，枸椽酸钠0.8 克，氯化钠0.42 克，蒸馏水100 毫升

　
将上述成分混匀，略加温使其溶解，分装小瓶（100毫升）。经10 磅、10 分钟高压灭菌。4 ℃保存备用。

　　
5.  培养液配置

（1）RPMI-1640培养液
 

RPMT-1640（FLOW公司出品）1 袋，三蒸水1000 毫升，电磁搅拌30 分钟：1N HCl 调PH7.2～7.4（约加2.5 毫升），过滤除菌，作无菌试验，4 ℃保存。

　　
（2）不完全RPMI-1640培养液
 

RPMI-1640 95 毫升，0.1M丙酮酸钠 1 毫升，0.2 M谷氨酰胺 1 毫升，1 M　Hepes 1 毫升，7.5 ％ NaHCO₃ 1 毫升，青霉素、链霉素（各1万单位）1 毫升

　　
（3）完全RPMI-1640培养液
 

不完全1640培养液90 毫升，灭活胎牛（或新生牛）血清10 毫升