细胞化学染色方法

实验原理

1. 细胞经甲基绿一呱咯宁混合液处理后，其中的 DNA 和 RNA 出现不同的呈色反应，一般认为这是由于带有负电荷的核酸对碱性染料呱咯宁和甲基绿具有亲和力，且这两种染料的作用有选择性，甲基绿染高聚分子的 DNA 呈蓝绿色，呱咯宁染低聚分子的 RNA 呈红色。由此对细胞中的 DNA 和 RNA 进行定位、定性、和定量分析。
2. 由于不同的蛋白质分子所带的碱性和酸性基团的数目不同，在 pH 值不同的溶液中，蛋白质分子所带的净电荷多少不同。如在生理条件下，整个蛋白质所带负电荷多，则为酸性蛋白质；带正电荷多，则为碱性蛋白质。据此，可将标本经三氯醋酸处理提出核酸后，用不同 pH 值的固绿染液分别染色，细胞内的酸性蛋白和碱性蛋白质显示出来。
3. 过氧化物酶能把许多胺类氧化为有色化合物，用联苯胺处理标本，细胞内的过氧化物酶能把联苯胺氧化为蓝色的联苯胺蓝，进而变为棕色产物，因而可以根据颜色反应来判定过氧化物酶的有无或多少。
4. 组织、细胞的多糖、粘多糖及粘蛋白等都可用 PAS 法来显示，其化学基础是利用过碘酸的氧化作用，打开碳链形成醛，生成的醛基与 Schiff 试剂中的无色品红反应形成紫红色化合物。

实验试剂

PBS 缓冲液(pH7.2)
甲基绿一呱咯宁醋酸缓冲液
纯丙酮
l/2 丙酮 1/2 二甲苯
纯二甲苯
70％乙醇
5％三氯醋酸
0.1％碱性固绿
0.1％酸性固绿
0.5％硫酸铜
联苯胺混合液
1％番红
无水乙醇
过碘酸酒精液
Schiff 氏酒精液
亚硫酸水
Ehrlieh
苏木精
95％乙醇
Carnoy 固定液(甲醇：冰醋酸=3:1，体积比)
实验设备

光学显微镜
解剖器材
蜡盘
载玻片
吸水纸
染色缸
盖玻片
水浴箱
实验材料

蟾蜍、小白鼠各一只
肝脏石腊切片
培养的 Hela 细胞
实验步骤

1. Brachet 反应一显示细胞内的 DNA 和 RNA
   (1) 接种 Hela 细胞于盖片上并培养 24～48 小时，使长成单层；
   (2) 取出盖片，用 PBS(pH7.2)轻轻冲洗盖片表面去除残渣；
   (3) 放入 Carnoy 固定液中固定 l 小时；
   (4) 浸入甲基绿一呱咯宁醋酸缓冲液中 30 分钟染色；
   (5) 取出盖片放入蒸馏水中轻轻漂洗 2～3 次(2～3 秒钟左右)，吸去水分。放入纯丙酮中分色 2～3 秒钟；
   (6) 放入 l／2 丙酮 1／2 二甲苯中 5 秒钟；
   (7) 放入纯二甲苯中透明 5 分钟；
   (8) 滴一滴中性树胶于载玻片上，将盖片标本面朝下封片；
   (9) 镜下观察。
2. 细胞内碱性蛋白和酸性蛋白的显示
   (1) 以破坏脊髓法处死蟾蜍，将其腹面向上放人蜡盘中，剪开胸腔，打开心包。小心将心脏剪一小口，取心脏血一滴滴在干净载玻片一端，推片，按此法制备二张血涂片，室温晾干；
   (2) 将涂片作好标记放在 70％乙醇中固定 5 分钟，室温晾干；
   (3) 放入 5％三氯醋酸中 60℃30 分钟，抽提出核酸；
   (4) 清水冲洗多次（3 分钟以上），以冲去痕迹的三氯醋酸；
   (5) 滤纸吸干玻片上水分；
   (6) 一张片放入 0.1％碱性固绿(pH8.0～8.5)中染色 10～15 分钟,另一张片放入 0.1％酸性固绿(pH2.0～2.5)染色 5～10 分钟；
   (7) 清水冲洗，盖上盖片镜检。
3. 细胞内过氧化物酶的显示
   (1) 取小鼠一只，以颈椎脱位法将其处死，迅速剖开其后肢暴露出股骨，将股骨一端斜向剪断，用 PBS 缓冲液湿润过的注射器针头吸出骨髓一滴滴到载玻片上；
   (2) 推片，室温晾干；
   (3) 将涂片放入 0.5％硫酸铜中浸 30 秒~1 分钟；
   (4) 取出涂片直接放入联苯胺混合液中反应 6 分钟；
   (5) 清水冲洗，放入 1％番红溶液中复染 2 分钟；
   (6) 清水冲洗，室温晾干；
   (7) 镜检或封片后镜检。
4. 过碘酸雪夫反应(PAS)——显示细胞内糖原
   (1) 取 l~2mm 厚的肝组织块，用 Carnoy 氏液 4℃固定 4～6 小时；
   (2) 乙醇脱水、二甲苯透明。石蜡包埋，切片；
   (3) 用 70％乙醇展片；
   (4) 脱蜡：二甲苯(1)5 分钟→二甲苯(2)5 分钟→100％乙醇 5 分钟→含 1％火棉胶的乙醇液 1 分钟→70％乙醇 1 分钟；
   (5) 直接浸入过碘酸酒精液反应 5～15 分钟，经 70％乙醇洗片刻；
   (6) 浸入 Schiff 氏酒精液反应 15 分钟；
   (7) 亚硫酸水洗三次，以洗去多余的非特异性结合的色素，以及扩散的染料；
   (8) 流水冲洗 3～5 分钟；
   (9) 蒸馏水洗；
   (10) 浸入 Ehrlich 苏木精复染 20~30 秒，使细胞核着色；
   (11) 脱水：95％乙醇 3 分钟二次→100％乙醇 3 分钟二次→二甲苯透明 10 分钟二次；
   (12) 加盖片镜检或树胶封固后镜检。