细胞原代培养实验——组织块直接培养法

孕鼠新生小鼠

RPMI1640培养基牛血清胰蛋白酶Hanks液酒精青霉素链霉素

培养瓶青霉素瓶废液缸血球计数板蜡盘手术器械大头针离心管小玻璃漏斗三角烧瓶平皿吸管试管移液管无菌纱布无菌眼科剪

一、将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2-3秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带入超净台内（或将新生小鼠在超净台内）解剖取肝脏，置平皿中。
 

二、用Hank's液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
 

三、用手术剪将肝脏剪成小块（1 mm²），再用Hank's液洗三次，转移至小青霉素瓶中。
 

四、将组织块转移到培养瓶，贴附与瓶底面。

五、翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。

六、于37℃静置3-5小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。

1.  严格进行动物皮肤消毒，使用三套器械取材。新生动物皮肤先用2%碘酒液消毒，成年鼠先用3%~5%碘酒液消毒后用75%酒精消毒。

2.  严格进行无菌操作，防止细菌、霉菌、支原体污染，避免化学物质污染。

3.  吸取液体前，瓶口和吸管进行火焰消毒；吸取液体时，避免瓶口和吸管碰撞。

4.  离心管入台前，管口、管壁应消毒。

5.  实验者离开超净台时，要随时用肘部关闭工作窗。

6.  使用过的器械用酒精棉球擦去血污后，移入另一个器皿中继续消毒，在浸泡器械时剪刀口要叉开放，镊子弯头要向下放，并加盖消毒。

7.  器材使用时既要注意用火焰消毒，又要防止烫伤、烫死细胞。经火焰消毒后的吸管一定要用Hanks液冷却。

8.  超净台内温度、湿度较大，在夏天工作时台内散热更慢，因此进行细胞悬液混匀、接种时，离火焰要稍微远些。

一、操作要领

1.  混匀操作要领

（1）火焰消毒吸管，用Hank's液冷却和湿润管内壁（这是因为刚分离的组织细胞易粘在管壁上）。
 

（2）吸管头插入管底。
 

（3）用吸管反复轻轻吹打组织块。
 

2.  器械的使用
 

（1）用工作台消毒镊子取浸泡在酒精中消毒的器械。
 

（2）器械置无菌干纱布内嚓一下。迅速通过火焰，冷却后使用。
 

（3）用过的器械置另一加盖的器皿中再消毒。
 

（4）器械按浸泡消毒的顺序使用。
 

（5）各套再消毒器械不可混用。
 

3.  除去组织块多余水分
 

用吸管将组织块推向青霉素瓶一角，然后将有组织块的瓶面翻向上方，吸去流向对侧的多余水分。

注意：多余水分若不除去，会使组织块剪切不细，消化后的细胞悬液清亮（细胞数少），并可见消化液中有线状或絮状物漂浮。
 

4.  细胞计数

（1）用吸管混匀待计数的细胞悬液。
 

（2）将一小滴细胞悬液从盖玻片与载玻片交界部位滴入细胞计数池中。
 

（3）沉降1分钟，低倍镜下计数血球计数板四大中格的结构完整的细胞，小细胞团计数为1。
 

（4）计数时，如果细胞压在格上，则数上不数下，数左不数右。然后按下式计算出每毫升悬液中的细胞数。

（四大中格细胞数/4）*10 000=细胞数/毫升