细胞原代培养实验

胎鼠 新生鼠

1640培养基 牛血清 胰酶 Hank’s液 碘酒

培养箱 培养瓶 青霉素瓶 小玻璃漏斗 平皿 吸管 移液管 纱布 手术器械 血球计数板 离心机 水浴箱

一、实验材料准备

1.  Hank’s液配方：KH₂PO₄ 0.06 g，Nacl 8.0 g，NaHCO₃ 0.35 g，KCl 0.4 g，葡萄糖1.0 g，Na₂HPO₄·H₂O 0.06 g，加H₂O至 1 000 ml。Hank’s液可以高压灭菌。4℃下保存。

二、具体操作

1.  将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2-3秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带入超净台内（或将新生小鼠在超净台内）解剖取肝脏，置平皿中。

2.  用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。

3.  用手术剪将肝脏剪成小块（1 mm²），再用Hank’s液洗三次，转移至小青霉素瓶中。

4.  视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。

5.  加入3-5 ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。

6.  静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。

7.  1 000 rpm，离心10分钟，弃上清液。

8.  加入Hank’s液5 ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。

9.  加入培养液1-2 ml（视细胞量），血球计数板计数。

10.  将细胞调整到5×10⁵/ml左右，转移至25 ml细胞培养瓶中，37℃下培养。

1.  自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。
 

2.  在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。
 

3.  凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。

4.  操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。
 

5.  点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。
 

6.  操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。
 

7.  不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。
 

8.  瓶子开口后要尽量保持45°斜位。
 

9.  吸溶液的吸管等不能混用