细胞同步化实验操作步骤

在肿瘤细胞培养过程中，细胞多处于不同的细胞周期时相中。不同时相的细胞对药物干预存在不同的反应，会影响实验的重复性，因此需要制备细胞周期一致的细胞。细胞同步化是解决该问题的好办法。细胞同步化是利用药物或其他方法使细胞停止在细胞周期的某个时相的技术，其基本原则是使细胞停留在细胞周期的特定时相上；停滞过程可以通过调节，恢复细胞周期；恢复后所有细胞以一致的步调在细胞周期中运行。细胞同步化实验为特定细胞周期转变、细胞动力学、细胞周期调控以及细胞在不同时相中对药物的敏感性研究奠定了基础。

【实验用品】

材料：HeLa细胞

器材：培养瓶、移液器、枪头、小烧杯、10ml吸管橡皮头、超净工作台、CO2，孵箱、倒置相差显微镜、离心机

试剂：无血清培养基、胎牛血清、RPMI-1640培养液、0.25％胰蛋白酶溶液、PBS

【实验步骤】

(1)血清饥饿法(将细胞周期阻滞在G0／G1)：

1)用0．25％胰蛋白酶消化对数生长期HeLa细胞，收集肿瘤细胞，600g离心5min，弃上清液。

2)用37℃预温pH7．4的PBS或无血清培养基洗涤细胞2次，重悬于培养液中，培养液中血清浓度低于O.5％。

3)在CO2孵育箱中37℃、5％CO2以及饱和湿度的条件下，培养24～48h。

4)弃去无血清培养液，加入正常血清浓度的培养液，使细胞重新进入细胞周期。细胞约在12h后进入S期。

(2)胸苷法(诱导细胞停滞在Gl／s期交界)：

1)添加含2mmol／L胸苷的新鲜培养液于培养对数生长期HeLa细胞细胞的培养瓶中。

2)在CO2孵育箱中37℃、5％CO2以及饱和湿度的条件下，培养12h。

3)弃去含有胸苷的培养液，用等量的完全培养液洗涤贴壁细胞2次。更换新鲜培养液，在37℃的CO2孵育箱中孵育16h。

4)弃去培养液，再加入2mmoL／I_胸苷的新鲜培养液，并孵育12～14h。

5)重复本实验(2)胸苷法中的第3)步骤。

(3)有丝分裂摇落法(将细胞截获于M期)：

1)取覆盖瓶底70％～80％的HeLa细胞细胞1瓶，弃去原培养液，用无血清培养液冲洗。然后加入：3ml 0．1％胰蛋白酶消化5min。轻叩培养瓶，使松动细胞游离下来。

2)60％离心5min，并调整细胞浓度至2．5x105个／ml，种入培养瓶，于37℃的CO2孵育箱中孵育6h。

3)摇动培养瓶，弃去未贴壁的细胞，更换培养液2次。加入培养液继续培养10h。

4)在10h结束，轻轻摇动或轻叩培养瓶，收集M期细胞，600g离心5min，并用培养液将细胞浓度调整到2．5×105个／ml。

5)种入培养瓶，于37℃的CO2孵育箱中孵育2h，细胞进入G1期。以上方法可应用流式细胞仪检测获得细胞的细胞周期(见流式细胞仪检测细胞周期)。

【结果分析】

根据以上三种方法进行得到不同时相的同步化细胞，用流式细胞仪检测细胞群体的细胞周期的均一性。

【注意事项】

(1)血清饥饿法必须注意无血清培养液处理细胞的时间，时间过长将引起细胞不可逆进入G0期或凋亡。

(2)有丝分裂摇落法必须注意胰蛋白酶的消化时间，过长的消化时间将引起其他周期的肿瘤细胞数目增加。