细胞固定切片和包埋实验

猫 部分显露肌梭

二甲砷酸钠缓冲液 戊二醛 四氧化锇 乙醇 环氧乙烷 甲苯胺蓝 派罗宁

玻片

一、固定

1. 将取出的肌肉置于含 5% 戊二醛的 0.1mol/l 二甲砷酸钠缓冲液内，PH 值为 7.2, 原位固定 5 min(戊二醛常由 25% 溶液稀释而成。因其易聚合，所以使用之前应保存于 4℃ 以下)。

2. 将肌纤维切成 10 mm 长，以确保至少含有一个肌梭，用上述相同固定液再固定 4~14d(总固定时间因实验室而异，固定时间的差异一般不会明显影响固定效果)。

3. 缓冲液清洗 30 min。

4. 置于缓冲液配制的 1% 四氧化锇固定 4 h(四氧化锇渗透速度很慢，但薄短筒状肌的厚度小于 1 mm，4 h 足以充分固定。一般将四氧化锇配成 2% 的储存液，装瓶并密封后储存于冰箱内。配制固定液时，向储存液内加入等量的 0.2mol/L 二甲砷酸钠缓冲液，便稀释成了所需的终浓度)。

二、脱水和包埋

1. 室温下将标本用 70%、95% 和 100%(两次）的梯度乙醇脱水，每次 10 min。

2. 用 1:1 的乙醇与环氧丙烷（1,2-环氧丙烷）混合液处理 15 min[环氧丙烷常用作中间溶媒，在石蜡包埋法中发挥类似「透明剂」的作用。大多数透明剂的折射指数与脱水蛋白及其他细胞内成分相似。该名称的由来是因为最初它们被用来固定透明的组织，虽然现在知道它们几乎没有这样的功能，但这个名称一直沿用至今。其他脱水方法见 Glauert(1975)]。

3. 环氧丙烧处理 15 min。

4. 用 1:1 的环氧丙烧与 Epon 的混合物（除了加速剂以外的成分）浸透，置入敞口的容器内，通风橱内过夜（挥发的环氧丙烷能帮助硬化剂更好地向组织块渗透)。

5. 倒掉瓶内剩余的渗透媒质，移入新鲜的纯 Epori 中。

6. 将切片平整地包埋于内衬铝箔的模具内，先 45℃聚合 12 h, 再 60℃聚合 24 h

三、切片和染色

1. 借助常规玻璃刀用超薄切片机手动切片，片厚 1/um，每 10 张切片收集为 1 组 (如需要，可用带氯仿蒸气的刷子靠近切片或通过电热丝的辐射热使切片平铺于水面上。玻璃刀应该经常更换，更换时应注意玻璃刀的准确复位，使用机械开关控制刀的运动以确保连续切割时能得到相同的切片。由于刀与组织块表面间的距离仅有几个微米，为了在更换新刀后仍能准确定位，可将刀背照亮，此时刀刃与组织块表面的缝隙看起来呈一条亮线)。

2. 用钻石刀将盖玻片（标准尺寸为 50 mmX20 mm) 切割成 3 mm 宽的窄条，将窄条的一端浸入液面下直接从水槽内收集切片（图 1-1A)(这些切片有的排列成串，有的单独存在。用一根粘有睫毛的牙签可以很容易地将切片导入窄条的表面，窄条需用钟表镊夹持,. 将窄条的一面靠近切片呈舌尖样伸出的一端，再使切片干燥，这个方法既简便又能使切片很好地粘附在窄条玻片上)。

3. 用软的织物将窄条的背面擦干，任切片漂浮在窄条前端的水滴中。

4. 用一块温度约为 70”C 的热板使切片干燥并贴附于窄条表面 [最好将一块玻璃载玻片永久性地固定于热板上，而将窄条置于载玻片上烘干（图 I-IB)]。

5. 用甲苯胺蓝（toluidineblue)(图 1-2A) 和派罗宁（pyronine)(图 1-2B) 在尚 pH 值条件下染色，将一滴染液滴于切片表面，加热直到染液滴从边缘处开始干燥为止。水洗后用 95% 乙醇分色 [染料配制：将 0.1 g 甲苯胺蓝、0.05 g 派罗宁和 0.1 g 硼砂 (四硼酸钠）溶于 60 ml 蒸馏水即可，配好的染液应定期过滤]。

6. 在热板上干燥后用 DPX[distrene(聚苯乙烯)-plasticizer(塑化剂)-xylene(二甲苯)] 封片 [一张载玻片上放置 5 个窄条，每个窄条有 10 张切片，用 50 mmX22 mm 的盖玻片封片（图 1—1C)。当然，封片时应注意将贴有切片的一面朝上]。
   

结果

猫的薄短筒状肌内肌梭的初级终末占据肌梭中部，大约长 350 mm，为了完整地观察肌梭，约需观察 50 张 1um 厚的纵向连续切片。通常认为肌梭的初级终末由单根 Ia 类初级传入纤维发出的外周终末分支及有髓或无髓纤维的终末前分支系统构成，这些有髓或无髓纤维的终末分支常分布于梭内肌纤维。梭内肌通常由六根三类不同的肌纤维构成。图 1-3 所示是使用 100 倍的消色差油镜（NA=1.25) 拍摄的照片；尺寸小于 0.5/um 的结构大部分已因溶解而丢失了。每个视野有一段长超过 100 啤的肌梭。照片中所见到的最显著结构是一根梭内肌纤维的中间部，就是核袋纤维。: 在初级终末区，梭内纤维的肌小节几乎全被聚集的胞核取代（图 1-3C 中的 n)。纤维表面的突出物是感觉终末（图 1-3F 中的 t)。在这些切片上都能见到有髓（图 1-3B 中的 mpt) 及无髓（图 1-3E 中的 pt) 感觉纤维的终末前分支部分。终末内的暗结构主要是线粒体。几个附属的、纤维母细胞样的细胞围绕在核袋纤维的周围并形成鞘-图 1-3 G 是基于相邻的连续切片重塑的、表面有感觉终末附着的核袋纤维的轮廓图。Banks 于 1986 年发表了完整终末的三维重塑图，1997 年 Banks 等人又将相似的连续切片分析法应用于初级终末的多编码位点以及与肌收缩控制器（pacemaker) 相互作用的组织-生理学相结合的研究。