促细胞分裂剂激活单核细胞
基本原理 ：
本方法是通过促细胞分裂剂与细胞表面受体相互作用，在体外触发细胞的多克隆激活。根据所使用的促细胞分裂剂的不同，应答细胞可以是T淋巴细胞、B淋巴细胞，或两者同时，或者是单核细胞。 细胞激活可以通过细胞增殖、细胞因子分泌、表面抗原表达和/或细胞体积的增加进行检测。例如在使用B细胞激活剂时，可以通过多克隆免疫球蛋白的分泌进行检测。
表1 常用的促细胞分裂剂和多克隆淋巴细胞激活剂
促细胞分裂剂 | 所 用 浓 度 | 应 答 细 胞 |
刀豆蛋白A ConA | 1- 10 μg/ml | T 淋巴细胞 |
植物凝集素PHA | 1-5 μg/ml | T 淋巴细胞 |
佛波醇酯PMA | 1-10 ng/ml | T 淋巴细胞 |
娄诺霉素+PMA | 100-500 ng/ml | T 淋巴细胞 |
脂多糖LPS | 2-25 μg/ml | 鼠B细胞（T不依赖型）， 单核细胞 |
美洲商陆PWN | 试验测定 | 人B细胞（T依赖型） |
葡萄球菌A，SAC | 1/1000-1/10000 | 人B细胞 |
试剂和设备：
l 细胞悬浮液；
l 96孔平底组织培养板；
l 含血清培养基（通常为 RPMI 1640,含10% 胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素）；
l 促细胞分裂剂（见表1），要求纯品或半纯品，有市售商品；
l 多通道移液器和微量移液器；
l 带570nm滤片的酶标仪；
l 超净工作台；
l CO2孵箱；
l 冷冻离心机。
操作步骤：
（一） 促细胞分裂剂制备
根据说明书将促细胞分裂剂重新溶解于水或培养液中，制成储存液（如100´），保存于-20℃。
（二） 促细胞分裂剂滴定
1．在培养液中稀释储存液到所需的第一个浓度，通常为理论最佳浓度的10倍；
2．在培养板或试管中直接将促细胞分裂剂进行浓度递减系列稀释（100 μl/孔）；
3．每孔平行重复三次；
（三） 细胞激活
1． 分离外周血单核细胞；
2． 室温下用培养液300´ g离心10分钟，收集并洗涤细胞；
3． 计数细胞并将细胞在培养液中重新悬浮至106细胞/ml，在培养板中每孔加入100μl；
4． 在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育（细胞增殖需2-3天；细胞因子测定测定6小时-2天；免疫球蛋白分泌测定需5-10天）；
（四）细胞激活定量测定方法
1． 细胞增殖检测方法采用MTT测定法；
2． 细胞因子分泌测定或使用市售商业化试剂盒；
3． 免疫球蛋白分泌测定采用ELISA检测
对照试验：
1． 阴性对照：不含促细胞分裂剂的培养液为对照组；
2． 促细胞分裂剂没有阳性对照。通常利用滴定曲线进行预试验确定促细胞分裂剂的最佳浓度以及最佳培养时间。
实验要点及说明：
1． 促细胞分裂剂的计量应答曲线通常为钟形，并且高浓度的促细胞分裂剂其效果较差；
2． 尽量避免细胞浓度过低，不要采用圆底培养板；
3． 抗CD3和抗TCR抗体可以用于T淋巴细胞激活；
4． 偶联到小珠上的抗免疫球蛋白抗体可以用于B淋巴细胞激活。
第一节 细胞冷冻和复苏
基本原理：
在长期的细胞培养过程中可能会出现微生物污染或基因型改变等情况，会导致具有优良特性细胞系的丢失。为防止这些细胞的丢失，细胞可以经快速冷冻并几乎无限期保存在非常低的温度下，如液氮（-176℃）。
试剂和设备：
l 冷冻液: 90%灭活血清+10%DMSO（或甘油），用0.45μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存；
l 培养液；
l 台盼蓝溶液（0.4%溶解于PBS）；
l 70%乙醇；