细胞培养技巧

细胞复苏

        细胞复苏和冻存讲究“慢冻快溶”，复苏时一定要将冻存在液氮或-80℃中凝固的细胞冻存液快速融化至37℃，使胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

复苏准备

●打开水浴锅加热至37℃。

● 超净台上放好离心管（一般15ml的），细胞培养瓶，移液管，紫外灭菌至少20至30分钟，吹风5至10分钟除去臭氧。

● 37℃预热好要复苏细胞的培养液，也可以不用预热培养液，根据细胞情况选择。

●向离心管中加约5至10ml培养液，从液氮罐或-80℃中取出冻存细胞，立即将冻存管放入37℃水浴中并轻轻摇动，待融化后（约2min即可）立即将解冻的细胞转移至含培养液的离心管中，800-1000rpm下离心5min，弃上清，加适量完全培养液轻轻吹打重悬细胞后转移至细胞培养瓶中，轻晃使瓶底液体分散均匀，标好细胞名称、代数、复苏日期，显微镜下观察后放入37℃，5%CO2培养箱中。一般贴壁细胞过夜即可贴壁，换液和传代时间根据不同细胞生长情况而定。

细胞复苏注意事项

☀复苏时动作要快，尽量减少胞内形成冰晶，影响复苏后细胞活率。

☀ 融化时尽量不要碰到管口，以免容易造成污染。

☀若一次性需要复苏细胞很多，可以分批水浴解冻，防止传热不佳使得细胞融化时间延长。

☀若需要同时复苏好几种细胞，提前在离心管和培养瓶上做好标记，或记住自己摆放的位置，不要弄混乱。

细胞传代培养     

1. 悬浮细胞传代

待培养液中酚红指示剂变黄，在已紫外灭菌后的超净台上吸出或倒出细胞悬液至离心管中（根据细胞液的量选择15ml或50ml离心管），800-1000rpm下离心5min，弃去营养匮乏的旧培养液，加预热好的完全培养液适量，轻轻吹打重悬细胞后，吸取适量细胞悬液转移至细胞培养瓶中，或直接取适量细胞悬液至新培养瓶中，再补加一定量新鲜完全培养液进行传代，有些脆弱的细胞用自然沉降法沉降细胞，吸去上面旧培养液加入新的完全培养液后吹散进行传代。传代接种的细胞密度根据不同细胞生长情况而定，一般间隔1-2天即可传代一次。

2. 贴壁细胞传代

待培养瓶底中细胞覆盖率达70%-80%时，在经紫外灭菌后的超净台上，弃去旧细胞培养液，用无菌1*PBS洗涤瓶底细胞1-2次，用1ml（T25培养瓶）或2ml（T75培养瓶）trypsin溶液37℃下作用细胞，待显微镜下细胞回缩变圆，少部分细胞出现流沙状时，快速吸去trypsin溶液，加预热好的新鲜完全培养液终止消化，轻轻吹打使细胞脱落且分散均匀，直接吸取适量细胞悬液转移至新培养瓶中，或800-1000rpm下离心去上清，加适量新鲜完全培养液吹打重悬细胞，然后转移适量细胞悬液至新培养瓶中，再加入一定量完全培养液，摇匀瓶底细胞液后进行培养。

细胞传代培养注意事项

☀ 吹打时每次不要排完移液管中液体，同时控制吹打节奏，这样不容易吹出泡沫，泡沫对细胞有损伤作用，而且很难再显微镜下观察清楚有没有完全吧细胞吹打下来。

☀不要等到贴壁细胞完全铺满瓶底，要留有一定空隙时细胞状态才良好。

☀消化时最好不要等到细胞成片飘起，否则细胞状态受影响且第二天培养中死细胞较多。

细胞冻存

       冻存的细胞要处在指数生长期。悬浮细胞和贴壁细胞经离心后用冻存液重悬，计数，冻存的细胞密度一般3*106-1*107 cells/ml，最好不少于1*106 cells/ml，否则复苏后难以养起来，将重悬计数后的细胞悬液以1-1.5ml快速分装至各冻存管中，迅速拧紧盖子，放入梯度冻存盒然后置于-80℃过夜，也可以先4℃放置30分钟，再-20℃放置1-2小时，最后-80℃过夜（16-18小时），若梯度冻存盒不够或无冻存盒，可以将冻存管置于泡沫盒中，用棉花包起来，棉花厚度约1cm，置于-80℃过夜，第二天取出-80℃细胞存放至液氮罐中，并在记录好存放位置信息。

冻存准备

●配制好冻存液。一般冻存液为培养液，血清，DMSO按照7:2:1的比例配制，也可以血清和DMSO按照9:1配制，不管哪种冻存液配制，血清多多益善，但DMSO都不可以多，以免对细胞造成损伤。

●准备好冻存管，标上细胞名称，代次，冻存批号，冻存日期。

●准备好细胞程序降温盒或冻存用的材料，程序降温盒放置室温后使用。

细胞冻存注意事项

☀程序降温盒有无需有毒异丙醇填充的，有利于实验人员身体健康。

☀DMSO有毒且皮肤会吸收，做好防护措施。DMSO本身不长菌，不需要做灭菌处理。

☀由-80℃转至液氮时迅速，避免温度上升影响细胞活性。

☀每个冻存管不要加入体积太多，以免冻存时凝固体积膨胀，撑开冻存管，且在下次复苏时，融化较慢，导致复苏后细胞存活率不高。