细胞增殖生长方面实验_接种存活率和克隆形成率法

如细胞冻存复苏后接种再培养时，常测定细胞接种率（Seeding Efficiency），即接种后细胞贴壁数。

细胞接种率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，从而细胞接种率和细胞接种存活率不完全相同。接种存活率在意义上虽与克隆形成率相同，但隆形成率概念更明确。形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞，因此用克隆形成率一词表示细胞活力更为准确。

克隆形成率与众多因素相关；从条件来说与底物、培养液、血清的量和质等有关；也受温度和pH 的影响。从细胞方面，克隆形成率反映细胞的两个重要性状，即群体依赖性和增殖能力。一般初代培养细胞弱，传代细胞系强；二倍体细胞弱，转化细胞系强；正常细胞弱，肿瘤细胞强。即随细胞生物学性状的不同，细胞克隆形成率差别很大；另外所有细胞的克隆形成率又受接种细胞密度的影响。

细胞

醋酸甲醇Giemsa琼脂DME

玻璃塑料板CO2温箱

一、冻存技术不良或细胞生活力弱时可降低接种存活率

为获得确切的接种存活率，接种时一定要接种分散为单细胞悬液。一般情况下把细胞直接接种在碟皿中即可。细胞接种密度和克隆形成率有一定关系。做克隆率测定时，一般持续一周，期间随时检查，到细胞形成克隆时终止培养，固定染色。

1.  细胞

80 %～90 %汇合细胞；

2.  悬液制备

用消化法制备成单细胞悬液，接种到适宜底物（玻璃或塑料瓶皿）；用多孔塑料板亦可（每孔底面积不宜小于1mm²）；

3.  培养

置温箱中培养；

4.  观察

隔48～96 小时，见细胞克隆已形成，终止培养；1：3 醋酸甲醇固定、Giemsa染色、镜下观察、计算克隆数。

二、软琼脂培养

特别是双层软琼脂培养，仍为当前检测转化细胞和肿瘤细胞最为常用的方法，与细胞恶性程度有很大的符合率。

1.  琼脂制备

用三蒸馏水分别制备出1.2 %和0.7 %两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40 ℃中勿令凝固；

2.  无菌制备出2xDME（含有2x抗生康和20%的小牛血清），保存在37 ℃中；

3.  底层琼脂制备

按1：1混合1.2 %的琼脂糖和2×DME后，取3 ml 混合液注入直径6 cm平皿中（如为10 cm平皿则加7～10 ml），令冷却凝固、置CO2温箱中备用；

4.  消化细胞

用营养液制成细胞悬液、计数；

5.  顶层琼脂制备

按1：1 比例让0.7 %琼脂和2xDME在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2 ml的细胞悬液，充分混均、注入已铺有1.2 %琼脂糖底层平皿中（直径6 cm 平皿加3 ml；10 cm平皿加7～10 ml），遂形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37 ℃CO2温箱中，培养10 天～14 天；

6.  观察细胞集落。

1.  确定克隆无绝对标准，一般情况下不能少于8 或10 个以上的细胞群才算作一个克隆；克隆检测宜用低倍镜，用解剖镜检查甚好。

2.  制备细胞悬液要求一定做到为单细胞，如分散不好，有很多两个以上的细胞团，接种后可导致克隆形成不均，将出现人为误差。

3.  接种密度不能过大，在细胞过密情况下，细胞克隆相互界限不清或易发生早期汇合。

4.  琼脂与细胞相混时，温度不宜超过40 ℃以免烫伤细胞。

5.  接种细胞密度每平方厘米最好不超过35 个；在直径6 cm的平皿应接种细胞1000 个。

6.  上层琼脂中含有细胞，因琼脂为半流体，细胞悬于琼脂中不下沉；如分散和混合良好，则细胞被均匀互相隔离；因两层琼脂中都含有DME，细胞可获充分营养进行增殖生长。

7.  由于细胞被相互隔离，孤立存在，消除了细胞相互影响，对细胞依存性大的细胞增殖生长不利；肿瘤细胞独立生存性强，仍能形成克隆。