细胞活力检测方法

细胞活性是判断体外培养细胞在某些条件下是否能正常生长的重要指标，如药物处理、放射性或紫外线照射、培养条件变化等。细胞活性检测方法有很多种，如台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、、ATP含量测定法、荧光染色法、比色法（MTT法）等。

一、ATP含量测定法---生物发光检测

有研究表明内源性三磷酸腺苷 (ATP) 的数量可以反映细胞的活性度，内源性ATP是活体细胞最基本的能量来源，细胞死亡时，ATP迅速水解。因此，测定细胞内源性ATP的含量可以及时反映细胞的活性和活细胞数量。基于ATP的细胞活力检测法是一种敏感而可靠的检测方法。

反应原理是活细胞在有氧和ATP的条件下，荧光酶催化荧光素发出荧光 (波长为562nm)，强度与ATP含量呈正相关。故所测得荧光强度可间接反映出存活细胞量。

Promega CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay是基于ATP检测的快速细胞活力检测法。（目录号：G7570）

-检测类型：发光

-检测标志物：ATP

-应用：细胞活力，细胞增殖，细胞毒性

-细胞类型：细胞系，原代细胞(悬浮或贴壁)

-检测步骤：一步法，均质检测

-操作时间：10min

-灵敏度：10个活细胞(96孔板)   

二、 荧光法检测

一些荧光染料对死细胞和活细胞有不同的作用效果，利用荧光显微镜检测细胞活性。如碘化丙锭 (PI) ，被活细胞排斥但能穿透正在死亡或已经死亡细胞的细胞膜，因此活细胞不被染料染上色，只有死细胞或是凋亡细胞才能染上红色。吖啶橙 (AO) 能透过质膜完整的细胞，嵌入细胞DNA，使之发出明亮的绿色荧光。溴化乙锭 (EB) 仅能透过胞膜受损的细胞，嵌入DNA，发橘红色光。也可应用AO-EB双染法鉴定细胞活性。这种检测方法相比传统的染料，具有灵敏度高，操作简便，结果容易分辨等特点，而且利用双染法还可以分辨活细胞、凋亡早期细胞、凋亡晚期细胞、死亡细胞。在细胞凋亡的检测上有很广泛的应用。

Alamar Blue是一种安全、稳定、易溶于水、且对细胞无毒的新型染料，可通过荧光产生或颜色变化指示细胞的代谢。活细胞线粒体酶能够将蓝色的氧化形式Alamar Blue变成红色的还原形式，同时发生可量化的荧光变化，无活性的细胞不能还原Alamar Blue 。荧光的强度或红色的强度反映了细胞增殖的程度，其颜色变化可用酶标仪测定；荧光变化可用荧光测定仪检测，激发波长530nm，散射波长590nm，使用荧光方法时具有更优秀的敏感性。AlamarBlue法操作简便，特异性和灵敏度高，重复性好，且AIamar Blue的使用不影响细胞正常代谢及基因表达，可在无菌条件下测定后继续培养扩增细胞，有利于对培养细胞的连续监测及深入研究。但由于Alamar BIue的分解产物是偏红色的，所以只能用无酚红培养基，且对培养的时间要求也相对MTT法来说要苛刻。

Promega CellTiter-Fluor™ Cell Viability Assay是一种革新性荧光法，是非裂解性的活细胞检测法，用于检测活细胞的活力状态和数量。（目录号G6080）

原理：该系统检测的是活细胞内的蛋白酶活性，该蛋白酶为保守的组成型蛋白，因而可作为细胞活力的生物标志物。该活细胞蛋白酶活性仅与完好的活细胞有关，是通过一种可穿透细胞膜的、可产生荧光的肽底物（Gly-Phe-AFC）来检测的。该底物进入活细胞后，被活细胞蛋白酶切割，产生荧光信号，该信号的强度与活细胞数量相关。当细胞膜的完整性丧失，以及漏出到周围培养基后，该活细胞蛋白酶的活性即消失。

-检测标志物：活细胞蛋白酶

-检测类型：荧光(380-400nm激发光/505nm发射光)

-应用：细胞活力，细胞增殖，细胞毒性，叠加检测

-细胞类型：细胞系，原代细胞(悬浮或贴壁)

-检测步骤：一步法，均质检测

-操作时间：0.5-3h

-灵敏度：40个活细胞(96孔板)

三、 比色法检测

MTT比色分析法是由Mosmann在1983年首创，其原理是活细胞内的线粒体中的琥珀酸脱氢酶可以将MTT[化学名为3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴盐，外观淡黄色]还原成蓝紫色结晶甲臜，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜 (DMSO) 能溶解细胞中的甲臜，溶液颜色的深浅与所含的甲臜量成正比。用酶标仪在570nm波长下测定OD值。MTT方法能简单、快捷、准确地测定细胞的增殖反应，而且能避免由于人为操作因素造成的试验误差，大大地提高了实验结果的准确性和重现性。MTT方法目前大多用于检测培养细胞的生长和增殖、新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤细胞敏感性试验等。加之其价格低廉，成为日前各实验室榆测细胞活性的首选方法之一。

但是MTT法不太适合于悬浮细胞，因为在溶解甲臜之前，需将培养液吸出，这一步很容易造成甲臜流失，因而导致实验结果偏差。若不去除培养基，培养基中的血清和酚红会影响实验结果。为了消除培养液中血清和酚红的影响，有人进一步提出改良的MTT法。即在不吸出培养基的前提下，利用一些有机溶剂，如酸化SDS、SDS-DMF酸性溶解液等直接溶解甲臜，都取得了不错的效果。

对由于MTT的产物甲臜不溶于水的缺点，研究人员又开发了很多种水溶性的四氮唑盐类：如 XTT、CCK-8 (又称WST-8) 等。XTT和CCK-8都是新合成的四唑氮衍生物，与MTT属于同类物质，它们都能被活细胞中线粒体内的脱氢酶降解而产生棕黄色水溶性的甲臜，能直接通过光谱吸收测定OD值，进而推测细胞的增殖情况。当与电子耦合剂PMS联用时，还能增强其还原反应，提高反应的灵敏性。与MTT法比较可知，这些方法主要优点是反应产物为水溶性，不需要使用裂解液溶解沉淀，也不需要吸取上清，对贴壁和悬浮生长的细胞均适用，检测时间缩短和处理步骤减少，也大大提高了实验的敏感性。缺点就是成本较高，XTT水溶液不稳定，需要低温保存或现配现用；而CCK-8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的活容易产生漏加或多加。

Promega CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS单溶液一步法细胞活力检测试剂盒)是一种比色法的新型细胞活力快速检测试剂。一步法操作，摆脱了传统MTT操作复杂问题，误差小，无需有机溶剂溶解，无需去除上清，活细胞检测等。（目录号G3582 G3580 G3581 ）

-检测类型：吸收光(490nm)

-检测标志物：线粒体脱氢酶

-应用：细胞活力，细胞增殖，细胞毒性

-细胞类型：细胞系，原代细胞(悬浮或贴壁)

-检测步骤：一步法，均质检测

-操作时间：1-4h

-灵敏度：1000个活细胞(96孔板)