发布时间:2020-07-14 09:38 原文链接: 细胞的离心分离基础和分离实例(七)

7 鼠肝主质细胞的多倍体级浮选分离 l   设备及样品:同例(5)  l   转速1350rpm(~210g)  l   温度4℃  l   初始充样流速12ml/min,直至细胞充满离心室 l   分别用流速19,32,41(ml/min)收集I,II,III 细胞,收集量分别为100ml,150ml 及100ml  l   已收集细胞储存于4℃  l   停止输液后转头停转,从离心室收集沉淀并收集混合室样品 l   用低速低温离心机甩平转头分别将收集液离心沉淀,1000×g,10 分钟,将沉淀与3ml 浮选介质混合制成倍体细胞悬液,4℃保存。 l   结果:细胞数量与活性分析

成分流量ml/min细胞数量×106活性(%)组成
原液
137.8842n,4n,8n,16n 及少量细胞聚集团及细胞碎片
I1939.8722n,4n, 少量细胞碎片
II3254.7854n(90%)
III4115.5834n,8n,细胞聚集团
沉淀
17.182同原液数据
混合室
5.285同原液数据
总数
127.0(92%)

  8 肝的Kupffer (星形细胞)及endothelial( 内皮)细胞纯化 l   浮选设备:同上述例  l   浮选用介质:GBSS  l   各种染色介质(参考各节)  l   肝窦状细胞(Sinusoidal)悬液 l   分离步骤

i.用不连续Nycodenz 梯度制备鼠肝Sinusoidal 细胞悬液(参见本文前例)
ii.安装离心浮选系统(Hitachi 或Beckman)
iii.标准离心室:3,250rpm,4℃
iv.初始流量13.5ml/min 注入1~5×108个细胞悬液
v.在流量分别为18,32,48ml/min 时分别收集100ml,150ml,150ml

收集液中含有白细胞(L)、星形细胞(K)、内皮细胞(E)及主质细胞(P),收集

液保存在4℃。
vi.离心后收集在浮选室中的细胞
vii.各种收集液离心沉淀:450g×10 分,沉淀分别混悬于3mlGBSS 中

  viii. 结果如下表:

成份细胞主要类型细胞总量×106活性染色细胞比例%组成%






P1E1PLEK
初始细胞液Sinusoidal167.48724.786.80.613.261.524.7
I 收集液(100ml)L19.9803.028.6/71.425.63
II 收集液(150ml)E82.5959.089.2/10.880.29
III 收集液(150ml)K34.79783.595.1/4.911.683.5
沉淀细胞聚集团9.89534.59616.04.044.635.4

  注: l  表成染色比例中 P1:Peroxidase 过氧化物,E1:Esterrase(酯酶) l   Sinusoidal 细胞制备方法参见前述内容。 9 鼠肝储脂细胞的离心浮选纯化(文献14

i.离心浮选设备(同上)
ii.转速3,250rpm,4℃,流量16ml/min
iii.Sinusoidal 细胞制备参照前述二阶不连续梯度离心法。
iv.加样:5~50×107 个细胞注入混合室
v.用16ml/min 及18ml/min 分别收集二次,最后收集在离心室中剩下的细胞液
vi.以上三种收集液分别450g×10 分钟离心,收集沉淀后分别用2mlGBSS 混成

悬液

  


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