细胞的离心分离基础和分离实例（二）

ⅰ. 差分离心：  在不存在密度梯度条件下分离细胞是这种方法的主要特点，差分离心可以是利用地球重力（1g），也可以是利用低速离心分离组织匀浆。在重力或离心力作用下一些比较大的细胞沉降速度较快，当它们已变成沉淀时，大部分比较小的的细胞由于沉降速度慢而仍留在上清液中。很明显在大的细胞变成沉淀时一部分接近离心管底的较小细胞在离心力也已变成沉淀，第一次离心可以使最大颗粒细胞全部沉淀但沉淀中少量的较小细胞降低了分辨率和纯度。我们可以用第一次离心同样转速和时间将第一次沉淀稀释后再离心（每次都要用同样的缓冲液稀释）（这叫在离心机中“洗”），重复数次可以得到较纯的大颗粒沉淀。各次上清液合并以更高转速离心，重复以上过程数次，就可以得到各种较纯的不同大小的颗粒的沉淀。如果利用某些特殊梯度材料（如dextran percoll(,)可以用(,)小的离心次数得到较好的结果。（文献4）。 ⅱ. 依赖重力加速度沉降：  不用离心机，将细胞悬液铺在预形成密度梯度上表面，在重力作用下细胞沉降。一般设计的密度梯度采用较小的密度变化范围，其最大密度小于密度最大的细胞密度。不同密度的细胞以很慢的速度按不同层次沉降。在最大密度细胞达到底部之前进行分部收集。（收集的方法参照“离心技术讲座”文章3a）   ⅲ. 利用速率－区带密度梯度离心法分离细胞：  在本质上与重力沉降是一样的，但是利用离心场来减少分离的时间。小容量样品用甩平转头，大容量样品用区带转头，对于较少数量的细胞（10⁶ ～10⁸），并且不同细胞的沉降速度有较大差异，用甩平转头离心分离可以得到很满意的结果。对于较大数量的细胞（＞10⁹）可以考虑利用区带转头。区带转头操作是离心技术中比较复什的分离工艺，需要较熟练的操作人员，细心的工作才能得到成功。由于在区带转头中离心分离不存在用离心管分离时产生的壁部效应（Wall  effect）参考加离心技术讲座文献3），可以一次离心收获大量比较纯的细胞。 曾有人在甩平转头的吊桶中加特殊的适配器（套管）来分离纯化少量的细胞（＞5 ×10⁷），提高了分离的纯度（文献5）。 如果不同细胞间尺寸差别不大，在离心场中沉降速度差别不大；或者需要制备大量的细胞用这个方法就不太合适。 iv.   离心浮选 利用一个特别的锥形转头，锥头方向与离心力方向相同，样品从锥头进入，利用离心力在圆锥形离心管中对细胞产生的逆流效应，可以有效地分离各种细胞（如各种培养细胞，酵母细胞，各种血细胞，受精卵等等）离心浮选转头一般配备在低速或高速低温离心机中（如Hitachi  的R5E 离心浮选装置，Beckman 的JE-6B  离心浮选系统）由于样品是从圆锥头部压入，每种细胞都受到离心力和由于锥度形成的流速梯度产生的反向力，不同形状、尺寸、不同密度的细胞在锥形离心室中不同位置达到力的平衡从而形成不同种类细胞的区带，按顺序从锥室大头排出。 这个方法的特点是 l 不需要制备密度梯度； l  可以分离10⁷ ～10⁹ 个细胞；  l  最使用于分离平均尺寸为2μm~50μm 的细胞；  l  由于锥形离心管用透明材料制成，在离心室门盖上可以安装透明窗用于观察分离情况并可以装置摄像机通过屏幕观察分离过程；  l  加样泵有较大的流量1～120 毫升/分，可以在很短时间内用较低的转速（最高 不超过5,000rpm）成功分离各种细胞；  l  不损伤细胞；  l  很高的分辨率；  l  设备投资很高，操作者需培训积累操作经验。因此应用受到很大限制。   3. 用于细胞分离的密度梯度 在讲座3 中已较详尽地叙述了密度梯度材料，梯度形状，梯度离心等问题，对于细 胞离心分离，对密度梯度材料还有一些特别重要的提示：  l  对细胞无毒性；  l  可以配制等渗液；  l  不会渗入细胞内部； l  离心后作分部收集，易从收集液中除去分离介质（如透析）；  l  较低的粘性系数。 用于细胞分离最好的梯度材料是：Percoll, Nycodenz, Ficoll, metrizamide 和小牛血清白蛋白。它们的性质已在讲座文献的（3），（3）a，（18）中已说明。 细胞分离常用的梯度可以是线性的，非线性的（凸指数或凹指数）连续的或不连续的，梯度制备方法参考讲座文献3（a）。 需要指出的是细胞离心配置的梯度液必须是等渗的，沿整个离心管长度方向渗透压变化要小于10％，也就是说细胞在沉降过程中收缩和膨胀都非常小，它们的基本性状和离心分离前基本一致。梯度材料研制和生产厂对于配制各种等渗液都提供了详细资料。（讲座文献18）