细胞的离心分离基础和分离实例（五）

例4：肝细胞的不连续密度梯度分离

这种方法适用于从肝窦状细胞（Sinusoidal）中除去红细胞和主质细胞（parenchymal）,离心结果是让红细胞沉淀，内皮细胞（Sinusoidal）浮上。

实验需要的基本设备和溶剂：

l  一台带甩平转头的低速、低温离心机；

l  GBSS；

l  在无NaCl的GBSS中的28.7% Nycodenz或 30% metrizamide

l  15ml塑料离心管；

l  窦状（Sinusoidal）肝细胞；

l  Trypan蓝染色剂；

l  过氧化物酶染色剂，及染色需要的设备；

l  生理盐水（0.9% NaCl）；

l  固定液：2.5%戊二醛在0.1M二甲基胂酸钠中（PH7.4）（二甲基胂酸钠有剧毒，可用0.1M磷酸盐代替）

l  培养液：（在通风柜或生物安全柜中配置）

9.5ml 1.0M NaCl；

         11mg 1-乙酸萘脂在0.5ml乙基乙二醇-乙醚中（在氮气中保存）；

         0.5ml 1.0M NaCl；

          0.25ml 4% 品红在2.0M HCL中，0.25ml 4% 硝酸钠在纯水中，共计0.5ml混合；

          把以上混合液调节到PH7.4，纤维纸过滤后待用；

         注意：30分钟内用完！

离心方法：

      i. 准备10ml Sinusoidal肝细胞在GBSS中悬液（1～4×10⁸个细胞）；

      ii. 在悬液中加14ml28.7%（W/V）Nycodenz 或30%（W/V）metrizamide 轻轻混匀；

      iii. 将以上溶液分别注入二个离心管，并在每管液面上缓铺1-2ml GBSS；

iv. 离心：400gx15分，室温，不用刹车，自由滑行减速至停转；

      v. 从GBSS 与梯度液之间慢慢地抽吸Sinusoidal 细胞

      vi. 用例2 同样的方法测定细胞数量和活力。

      vii. 酯酶染色反应

      l  数滴细胞悬液（～0.5×10⁶ 个细胞）滴入1～2ml 固定液，4℃，7 分钟

      l  700g×3 分，低速离心后，去上清，沉淀用0.9％Nacl“洗”二次（在离心机中，700g×3

      分“洗”2 次）

      l  取“洗”后沉淀与200μl 0.9％ Nacl 作成悬液，加入等容积培养液，37℃培养染色10 分

      钟

      l  用血球计数器测定染色百分比：Kupffer, endothelial 及Parenchymal 细胞染成红色，红

      细胞及淋巴细胞不被染色，储脂细胞微染。

      l  结果可用下表表示

例5：用双阶梯不连续梯度部分纯化储脂细胞，需要的设备和化学试剂同例3。

      i. 从一只成年雌鼠取肝制成Sinusoidal 细胞悬液（1～4×10⁸ 个细胞在12ml GBSS 中）

      ii. 以6 倍容积的28.7％（W/V）Nycodenz 或30％（W/V）metrizamide 配以4 倍容积的

      GBSS 来稀释梯度液。取二个离心管（15ml），每管注入5ml 已稀释的梯度液（17.2％

      Nycodenz 或18％metrizamide）

      iii. 将8ml 未稀释的梯度原液与12ml 细胞悬液i 轻轻混合，混合后溶液中梯度液浓度为

      11.5％Nycodenz 或12％metrizamide

      iv. 每个离心管液柱上铺5ml 已稀释的细胞悬液与梯度液（iii 液），再在液面上铺1～2ml

      GBSS 形成双阶梯不连续密度梯度。

      v. 低速离心1400g（2,700~2,800rpm）×17 分，20℃，无刹车，自由滑行至停转。

      vi. 用吸管从二个离心管的低密度界面及高密度界面上分别抽出细胞层。

      vii. 用与例3 同样的方法测定细胞产率、活力及组成并作成下表：