细胞、细胞器及组分的分离与观察1

叶绿体的分离与荧光观察
一、实验目的
了解叶绿体分离的一般原理和方法,并熟悉应用荧光显微镜方法观察叶绿体荧光现象。
二、实验原理
叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器,能发生特有的能量转换。利用低速离心机可以分离叶绿体,其分离在等渗溶液（0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液）中进行,目的是为了防止渗透压的改变引起叶绿体的损伤。将匀浆液在1000r/min离心,去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞,然后,3000r/ min离心,可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。在室温下进行分离要迅速。
三、实验用品
材料：菠菜叶片
试剂：蒸馏水,0.35mol/L氯化钠溶液,0.01%吖啶橙
仪器：普通离心机,研钵,天平,荧光显微镜,载玻片,盖玻片,镊子,恒温箱,培养皿,滤纸,试管,试管架,移液管, 滴管,烧杯,离心管
四、实验步骤
1.选取新鲜的菠菜嫩叶,洗擦干后去除叶梗及粗脉,称3g于0.35mol/L氯化钠溶液15ml中置组织捣碎机或研钵中。
2.利用组织捣碎机低速（5000r/min）匀浆,3-5min,或研磨成匀浆。
3.用6层纱布过滤,滤液盛于烧杯中。
4.取滤液4mL在1000r/min下离心2min,弃去沉淀。
5. 将上清液在3000r/min下离心5min,弃去上清液,沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）。
6.沉淀用0.35mol/L氯化钠溶液悬浮。
7.取叶绿体悬液1滴置于载玻片上,加盖玻片后用普通光学显微镜观察。使用荧光显微镜观察时,将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上,再滴加1滴0.01%吖啶橙荧光染料,盖上无荧光的盖玻片后即可观察。
8.观察叶绿体的形态结构、叶绿体发射荧光的现象。

线粒体和细胞核的制备与观察
一、实验目的
1.对分离得到的细胞核及线粒体进行活性鉴定。
2.掌握用差速离心技术分离制备动物细胞核及线粒体的方法
二、实验原理
利用细胞核与线粒体在一定介质中的沉降速度的差异,可采取分级差速离心的方法,将细胞核与线粒体逐级分离出来（差速离心技术）。
线粒体是真核细胞特有的进行能量转换的重要细胞器。将动植物组织制成匀浆,在适当的悬浮介质中差速离心法可以分离细胞线粒体。在一定的离心场中（选用离心机的一定转速）,球心颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。在一均匀的悬浮介质中离心一定时间,组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间,就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部,从而分批收集。细胞器沉降先后顺序先后是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子。
悬浮介质通常采用缓冲的蔗糖溶液,它较接近细胞质的分散相,在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性；pH7.2的条件下,亚细胞组分不容易聚集成团,有利于分离。整个操作过程样品要保持在0℃-4℃,避免酶失活。