细胞、细胞器及组分的分离与观察2

细胞器标记酶的测定是评价细胞器内膜组分和分离纯度的主要依据,如线粒体内膜上分布有细胞色素氧化酶,该酶使詹纳斯绿B染料保持在氧化状态呈现蓝绿色,从而使线粒体显色,而胞质中的染料被还原成无色。

詹纳斯绿B是一种活体染料,能对动植物的细胞或组织在活体状态下进行无毒害的染色。由于染料（碱性染料）的胶粒表面带有阳离子,酸性染料的胶粒表面带有阴离子,而被染部分本身具有阳离子或阴离子,这样,它们彼此之间发生吸引作用,染料就被堆积下来。染色法可以显示出活细胞内的某种天然结构存在的真实性,而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以引致细胞的死亡。

Gimesa是一种复合染料,即为酸性染料与碱性染料的结合物。在水溶液中电离为带正电和负电的染料离子。

三、实验用品

材料： 鼠肝脏,猪肝脏

试剂：

(1)0.25mol/L蔗糖-0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸缓冲液(pH7.4)

0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液10ml

0.1mol/L盐酸8.4ml

加双蒸水到100ml,再加蔗糖使浓度为0.2mol/L

(2)0.34mol/L蔗糖-0.01mol/LTris-盐酸缓冲液（pH7.4）,配法同上。

(3)1%詹纳斯绿B(Janus green B)染液,称取50mg（pH7.4）,詹纳斯绿B溶于5ml生理盐水中,稍微加热使之溶解后,过滤,即为1%原液。

(4)姬姆萨染液（Giemsa）：称取姬姆萨粉0.5g,甘油33 ml 、纯甲醇33ml。先在姬姆萨粉中添加少量甘油,然后在研钵内研磨至无颗粒状,再将剩余甘油倒入混匀,56℃左右保温2h使其充分溶解,最后加甲醇混匀, 成为姬姆萨原液,保存于棕色瓶。使用时吸出少量,用1/5mol/L磷酸缓冲液作10-20倍稀释。

(5)1/15 mol/L磷酸缓冲液（pH6.8）：1/15 mol/ L磷酸二氢钾50 ml,1/15 mol/ L磷酸氢二钠50 ml

(6)卡诺（Cornay）固定液：无水乙醇6 ml冰醋酸1 ml氯仿3 ml

(7)生理盐水

仪器：解剖刀,剪刀,漏斗,玻璃匀浆器,尼龙织物,刻度离心管,显微镜,冷冻高速离心机。

四、实验步骤

1. 制备肝细胞匀浆：实验前将鼠空腹12小时,击头处死,剖腹取肝,迅速用生理盐水洗净血水,用滤纸吸干水,称取肝组织1 g,剪碎；用预冷的0.25mol/L蔗糖溶液洗涤数次。然后按每克肝加9 ml预冷的0.25mol/L蔗糖溶液的量,分数次添加蔗糖溶液,在0℃-4℃冰浴中用玻璃匀浆器将肝制成匀浆,肝匀浆用双层纱布过滤(滤液制一张涂片 ①,自然干燥)。

2.差速离心：将0.34 mol/ L 蔗糖溶液4.5 ml放入离心管,然后沿管壁小心地加入4.5 ml鼠肝匀浆覆盖于上层。用冷冻控温的高速离心按下图顺序进行差速离心。

3.分离物鉴定：

（1）细胞核：将干燥后的三张涂片加入Carnoy固定液15min,晾干。Giemsa染液染10min,蒸馏水漂洗数秒,用滤纸吸干水,用显微镜（40×）检查,细胞核呈紫红色,混杂的细胞质为浅蓝色碎片。

（2）线粒体：取线粒体沉淀滴在载玻片上,勿太密。滴加 1%詹纳斯绿溶液染色,10分钟后用光学显微镜观察,线粒体呈蓝绿色,小棒状或哑铃状。

(涂片过程）

注意事项：

1.试验全过程要在0～4℃进行,如果使用非冷冻控温的离心机一般只宜分离细胞核和线粒体,同时注意使样品保持冷冻；尽可能充分破碎组织,缩短匀浆时间。整个分离过程不宜过长。