细胞表面标记的检测技术

APAAP

TBS 固定液

载玻片 制片机 湿盒 显微镜

1.  分离外周血单个核细胞（PBMC），洗涤后用含10 ％FCS PMI1640调整细胞浓度约5×10⁶ /ml

2.  自制制片机上制片，充分干燥

　　　　　　　　
3.  用含丙酮-福尔马林固定液中固定30 秒钟

4.  自来水、蒸馏水依次冲洗

5.  用TBS稀释特异性McAb或阴性对照抗体（1∶50～500），每片加30～50 μl

6.  室温湿盒孵育30 min，或4 ℃冰箱湿盒中过夜

7.  充分用TBS冲洗后，加1∶50羊（兔）抗鼠IgG（GAM或RAM IgG）30～50 μl

8.  室温湿盒孵育30 min

9.  TBS冲洗后加碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶（1∶2000）复合物（APAAP）

10.  TBS冲洗后可重复叠加GAM或RAM IgG和APAAP2 次，每次孵育10 min

11.  冲洗后底物液显色10～15 min

12.  自来水冲洗，苏木精衬染，光镜下观察

1.  细胞表面抗原的强度以新鲜分离细胞制片、固定为好。若需保存最好干燥密封贮存于-20 ℃低温冰箱中，使用前必须充分干燥后固定。

　　
2.  APAAP中碱性磷酸酶和抗碱性磷酸酶的比例非常重要，抗体浓度过高，易封闭桥抗影响染色结果。

　　
3.  一抗、桥抗和APAAP复合物使用的浓度视细胞表面抗原密度而定，每步洗涤要充分。