细胞的超微结构实验

成年大鼠的小脑皮质 大鼠经腹腔内注射戊巴比妥钠麻醉后取出小脑

Kamovsky固定液 多聚甲醛 戊二醛 二甲砷酸钠

一、固定

1.用 Kamovsky 固定液灌注。Kamovsky 固定液配方如下（以 100 ml 固定液的量计)：

A 液：2 g 多聚甲醛溶于 60℃ 的 40 ml 水中，将 2~6 滴 1mol/L 的 NaOH 慢慢滴入直到溶液变清亮。
B 液：25% 戊二醛 10 ml 与 0.2md/L 二甲砷酸钠 50 ml 混合，pH 值为 7.3。

使用前将两种液体贮存于 4L，使用时再混合为 100 ml 固定液。不同灌注方法的详细步骤也不相同，这里所采用的灌注法既简单又可靠，它能最大限度地减少开始麻醉和有效固定之间的时间。蠕动加压泵（Watson-MarlowMHRE200) 为灌注提供动力（也有许多作者用静水压作为动力)，插管完毕后立即导入固定液。起初灌注液保持相对低的流速，出现固定液起效的征兆（四肢和尾巴伸展）后的短时间内应逐渐増加流速。固定过程持续大约 10 min，固定 1 只成年大鼠需要 500 ml 固定液。不需要额外地监测灌流时的压力。

插管用 21 G 皮下注射针制成，在中点处折弯，尖端磨平。将一滴环氧树脂滴于针尖的一侧，然后把它涂抹在针尖周围，以利于导管经左心室尖的切口插入升主动脉。插管后用动脉钳将插管和心脏夹在一起并置于适当的位置。在手术和插管过程中，蠕动加压泵应保持低速持续运转，以防止气泡进入血管。当插管固定于适当的位置后，立刻剪开右心房，同时加快泵转动的速度，导入固定液开始固定。

2.灌注完毕后，取出大脑并置于新鲜的固定液中。组织块或组织片应切得足够薄 (不超过 1 mm), 以利于四氧化锇渗透。四氧化锇后固定、脱水及包埋的步骤与上面例 1 所述相同。

二、切片

1.切片厚 1 um，甲苯胺蓝和派罗宁染色后用于初步观察和调整，方法同例 1。

2.用超薄切片机切取约 70~90nm 厚（呈银白-淡金黄色）的切片，将切片收集于涂有聚乙烯醇的铜网上，干燥后用枸橼酸铅和醋酸铀染色。

结果

有人曾描述过小脑皮质内几种不同的突触类型，其中的大多数突触属于轴-树突触。我们在此仅简要地举三个例子：一个来自于分子层，另外两个来自于颗粒层内的突触小球。就突触而言，分子层内主要是颗粒细胞的平行纤维与 Purkinje 细胞的树突棘形成的突触联系。图 1-4A 所示为分子层最外层的水平切面，含有横切的平行纤维（pf)。可见几个由平行纤维与树突棘形成的突触（s)，注意这些突触常与胶质细胞的突起形成紧密联系，而平行纤维（颗粒细胞的轴突）聚集在一起且缺乏胶质细胞形成的单个髓鞘。图 1-4B 是一个相同类型突触的放大像，它属于 Grayl 型突触，特别应该注意的是突触后膜增厚以及在突触前、后膜间有一薄层细胞外基质。突触前囊泡为圆形（rv)。图 1-4C 所示颗粒层内的一个突触小球，它是由一个位居中央的苔藓纤维（mf) 的玫瑰花瓣状终扣和周围的许多颗粒细胞的树突（gcd) 以及 Golgi 细胞的轴突形成的复杂结构。苔藓纤维和 Golgi 细胞轴突都与颗粒细胞的树突形成轴-树突触，但它们分别属于 Gray1 型和 Gray2 型突触。图 1-4D 凊楚地显示 Gdgi 细胞与颗粒细胞间的突触。突触后膜增厚远不如 Grayl 型突触明显，且突触前、后膜之间无明显的细胞外基质。许多突触前囊泡都属于扁平囊泡。以往的研究已经揭示平行纤维和苔藓纤维是兴奋性的，而 Golgi 细胞是抑制性的。