细胞骨架系统的显示与观察

细胞骨架(cytoskeleton)是指真核细胞胞质中错综复杂的纤维状网络结构，主要包括微管（microtubule，MT，20~25 nm）和纤丝（filament）两大类；另外，胞质中还散布着一些3~6 nm的细小纤维。按纤维的直径、组成成分以及组装结构的不同，纤丝又可分为微丝（microfilament，MF）、中间丝（intermediate filament，IF）和粗丝（thick filament，TF）三类。微丝是肌动蛋白亚单位组成的螺旋状纤维（F-actin），直径为6~7 nm，又名肌动蛋白丝，其长度不定，多分布在近细胞膜的下方。微丝在不同种类的细胞中，它们又与某些结合蛋白一起形成不同的亚细胞结构，如张力纤维（stress fiber）、肌肉细丝、肠上皮绒毛轴心等。现在观察微丝可以用电镜、组织化学、免疫细胞化学等手段。本实验用普通光镜观察到细胞骨架，是因为骨架纤维成束分布、结构经染色后，有夸大作用。由于细胞经TritonX-100抽提后剩下的主要是细胞骨架成分，使得显现更清晰。

细胞骨架在通常情况下不稳定：如低温、高压、饿酸处理等。当用适当浓度的TritonX-100处理细胞时，能溶解质膜结构中及细胞内许多蛋白质，而细胞骨架系统的蛋白质却不被破坏显得更清晰，M-缓冲液洗涤细胞，可以提高细胞骨架的稳定性，戊二醛固定能较好地保存细胞骨架成分，经考马斯亮蓝R250染色后，可使细胞骨架蛋白着色，而胞质背景着色弱，有利细胞骨架纤维显示。

1．实 验 目 的
1．1. 掌握考马斯亮蓝R250（coomassie brilliant blue R250）染细胞胞质微丝的方法。
1．2. 对细胞内微丝的分布有一个整体上的认识。
2．实 验 原 理

考马斯亮蓝R250是一种普通的蛋白质染料，它可以使各种细胞骨架蛋白质着色，并非特异地显示微丝，但是由于有些细胞骨架纤维在该实验条件下不够稳定，例如微管；还有些类型的纤维太细，在光学显微镜下无法分辨，因此我们看到的主要是微丝组成的张力纤维，直径约 40nm左右。张力纤维形态长而直，常常与细胞的长轴平行并贯穿细胞全长。观察微丝可以用电镜、组织化学、免疫细胞化学等手段，本实验主要介绍用考马斯亮蓝R250显示由微丝组成的张力纤维的实验方法。
染色时用的M-缓冲液，其中咪唑是缓冲剂，EGTA和EDTA螯合Ca2+离子，溶液中并提供 Mg2+离子，在此低钙条件下，骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张。
3．实 验 用 品

3．1 材料 洋葱鳞茎内表皮细胞或培养的成纤维细胞。
3．2 试剂
3．2．1. 0.01 mol/L 磷酸盐缓冲生物盐水(PBS)配法
0.2mol/L Na2HPO4/KH2PO4缓冲液(pH7.3) 50 ml
NaCl 0.15 mol/L
重蒸馏水 至1000 ml
其中PB的配法: 0.2mo1/L Na2HPO4 77 ml
0.2mo1/L NaH2PO4 23 ml
3．2．2. M-缓冲液
咪唑(imidazole, pH6.7) 50 mmol/L
KC1 50 mmol/L
MgCl2 0.5 mmol/L
EGTA l mmol/L
EDTA 0.l mmol/L
巯基乙醇(mercaptoethanol) l mmol/L
甘油 4 mmol/L
用1 mol/L HCl调pH至7.2。
3．2．3. 1%的Triton X-l00/M-缓冲液
3．2．4. 0.2%考马斯亮蓝R250染液，溶剂是:
甲醇 46.5 ml
冰醋酸 7 ml
蒸馏水 46.5 ml
3．2．5. 30%戊二醛-PB溶液，pH7.2
3．3 器材 普通光学显微镜、恒温箱、培养皿、烧杯、吸管、载玻片及盖玻片、镊子。
4．实 验 方 法
撕取一薄片洋葱鳞茎内表皮细胞（约1cm3）于载玻片上或取长有成纤维细胞的盖片条
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PBS液轻轻涮洗
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l% TritonX-l00/M-缓冲液处理l5min（室温或37℃）
（Triton X-l00是非离子型表面活性剂(去污剂)，能增加细胞膜通透性并抽提部分杂蛋白质，使骨架图像更清晰）
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M-缓冲液轻轻洗细胞3次（稳定细胞骨架）
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3%戊二醛-PB液固定细胞5~l5min
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PBS液洗细胞若干次
↓滤纸吸干
0.2% 考马斯亮蓝R250染片30min
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小心地用水漂洗
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空气干燥
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直接观察或用树脂封片