细菌中重组蛋白的大量提取实验

利用细菌获得用于纯化的重组蛋白是非常方便的。适用于细菌细胞蛋白提取的方法包括超声波处理、玻璃珠研磨、钒土或石英砂研磨、French加压罐高压剪切细胞和溶菌酶处理。这些方法适用于从各种革兰阴性菌和革兰阳性菌中制备蛋白提取物。通常是使用酶的方法破坏细胞，因为细胞在悬浮液中能获得相对均一的处理。

表达目标重组蛋白的细菌细胞

二硫苏糖醇（DTT) DNaseI 1×Laemmli样品缓冲液 裂解缓冲液

离心机

①4℃、3000g离心15min收集细菌。

②用裂解缓冲液洗细胞，除去残留的培养基。重复步骤①，离心收集洗过的细胞。

③倒出上清，称沉淀的湿重。

④每克细胞沉淀用约3ml裂解缓冲液重悬，4℃条件下搅动悬浮液30min。如果沉淀物在30min后没有完全悬浮，用韦林搅切器低速混合悬浮液1min。

⑤加溶菌酶至终浓度1g/L，并在4℃条件下孵育35min，温和振荡。增加溶菌酶的浓度至10mg/ml，可以加速裂解。如此，在4℃条件下，5min就可以获得充分的裂解

⑥按顺序加人如下试剂：

NP-40至终浓度5g/L

MgCl2至终浓度5mmol/L

DNaseI至终浓度40/zg/ml

4℃搅动悬浮液30mm，除去黏性的核酸。细菌提取物包含40%〜70%蛋白、10%〜30%核酸、2%〜10%多糖和10%〜15%脂类。细胞裂解过程中DNA的释放经常导致提取物高度黏稠，这可能在接下来的层析纯化步骤中引起严重的麻烦。除了用DNaseI处理外，也可以加入带正电荷的化合物，如鱼精蛋白硫酸盐(至5mg/g沉淀湿重）或聚乙稀亚胺，通过中和溶液来除去细胞提取物中的DNA(还伴有其他核酸，在一些情况下，还有高度酸化蛋白）。

实验提示：用带正电荷的化合物除去DNA的方法不能用于包含体的提取。因为沉淀的DNA将与包含体一起被离心下来。

⑦悬浮液在4℃条件下23000g离心30min。

⑧用含有DTT的Laemmli缓冲液重悬一小部分沉淀。

⑨利用分析级SDS-PAGE分析可溶性蛋白组分（上清）和沉淀组分，找出目的蛋白存在的位置。如果目的蛋白位于难溶的沉淀组分中，则可能是形成了包含体，那么目的蛋白就需要依照其他方案来溶解和纯化。若目的蛋白位于上清中，则将其贮存于4℃，以备后续纯化方案使用。

1×Laemmli样品缓冲液：

2%SDS

10%甘油

60mmol/L Tris-Cl(pH6.8)

0.01%溴酚蓝

通常把Laemmli样品缓冲液制成2×或5×的储液比较方便。在使用前，加DTT至终浓度100mmol/L。

裂解缓冲液：

50mmol/L Tris-Cl(pH7.4)

250g/L蔗糖

可以加人EDTA(至终浓度10mmol/L)螯合金属离子，以降低金属离子蛋白酶的活性。