细菌生化反应检查实验

实验材料 细菌

试剂、试剂盒 蛋白胨氯化钠蒸馏水蛋白胨水葡萄糖乳糖甘露醇蔗糖麦芽糖溴甲酚紫溴麝香草酚兰酚红

仪器、耗材 试管糖发酵管

实验步骤

一、细菌生化反应常用培养基的制备

1.  蛋白胨水

成分：蛋白胨1.0 g、氯化钠0.5 g、蒸馏水100 ml。

将上述成分加热溶解后校正pH7.6，分装试管，15磅15 min高压灭菌备用。常用于制备糖发酵培养基或用于检查细菌的靛基质产生试验等。

2.  糖发酵管

成分：蛋白胨水，葡萄糖、乳糖、甘露醇、蔗糖或麦芽糖等糖，溴甲酚紫(B.C.P)、溴麝香草酚兰(B.T.B)或酚红(P.R)等指示剂。

在蛋白胨水中加入某种糖(0.5～1%)和指示剂，分装于带一倒立小管的小试管中(图2-5)，15磅20 min高压灭菌后备用。常用于糖发酵试验。

3. 葡萄糖蛋白胨水

成分：蛋白胨 　　　　0.5 g

葡萄糖 　　　　0.5 g

磷酸氢二钾 　　0.5 g

蒸馏水 　　　　100 ml

上述成分混合溶化后校正pH至7.0，分装试管，10磅20 min高压灭菌备用。用于V-P试验和甲基红试验。

4.  枸橼酸盐培养基

成分：枸橼酸钠 　　　　　　　　　0.2g

硫酸镁 　　　　　　　　　　0.02g

磷酸二氢铵 　　　　　　　　0.1 g

磷酸氢二钾 　　　　　　　　0.1 g

氯化钠 　　　　　　　　　　0.5 g

琼脂(经流水连续彻底漂洗) 　2.0 g

蒸馏水 　　　　　　　　　　100 ml

B.T.B酒精溶液(0.5%) 　　　1.6 ml

加热溶化各种成分后校正pH至6.8，再加入0.5%B.T.B乙醇溶液混匀，分装试管，8磅15 min高压灭菌，趁热取出置成斜面。 用于枸橼酸盐利用试验。

5.  醋酸铅培养基

成分：普通琼脂培养基　　　 100 ml

硫代硫酸钠 　　　　　0.25 g

醋酸铅溶液(10%) 　　1 ml

先溶化普通琼脂培养基，然后加入硫代硫酸钠，校正pH为7.2，煮沸过滤，10磅20 min高压灭菌，取出后无菌操作加入已灭菌的10%醋酸铅溶液1 ml，混匀后装于小试管，直立凝固后备用。用于检测硫化氢的产生。

6.  尿素培养基

成分：蛋白胨 　　　　　　　　0.1 g

氯化钠 　　　　　　　　0.5 g

磷酸二氢钾 　　　　　　0.2 g

琼脂 　　　　　　　　　2.0 g

蒸馏水 　　　　　　　　100 ml

酚红溶液(0.6％) 　 　　0.2 ml

葡萄糖溶液(10％) 　　　0.1 ml

尿素(20％) 　　　　　　1 ml

在蒸馏水内加热溶化蛋白胨、氯化钠、磷酸二氢钾和琼脂，校正pH7.4，过滤后加入0.6%酚红溶液混匀，8磅15 min高压灭菌，取出待冷至60℃，加入灭菌的10%葡萄糖溶液和20%尿素，分装于小试管内，凝成斜面备用。用于尿素分解试验。

二、细菌生化反应检查

1.  糖发酵(Fermentation of sugars)

将细菌接种于糖发酵管中，37℃培养18～24 h后观察结果。必要时可培养更长时间后再判定结果。

细菌如分解糖时，则产酸，使指示剂变色(一般记录符号是"十")；有些细菌在分解糖的同时还产生气体，则倒立小管中有气泡出现(记录符号为"⊕")；如细菌不分解该糖时，指示剂不变色，不见培养液混浊(记录符号为"―")。

2.  IMViC 包括下述四种试验

（1） 靛基质产生(Production of indole)

将细菌接种于蛋白胨水中，37℃培养18～24 h。有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸而产生靛基质，靛基质无色，不能直接查见，此时滴加数滴靛基质试剂(Kovacs试剂)于培养基的液面上，其接触面呈玫瑰红色者为阳性，仍呈黄色者为阴性，若颜色不明显，可再加4～5滴乙醚，振荡试管使乙醚分散于液体中，若培养液中有靛基质存在，就可以被提取至乙醚层中，颜色反应较为明显。

(注)Kofacs试剂：取对二甲基氨基苯甲醛(Paradimethylaminobenzaldehyde)4g，加95%酒精380 ml，浓盐酸80 ml即成。

（2） 甲基红试验(Methyl red test)

将细菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，37℃培养48 h后，再向其中加入甲基红试剂3滴。大肠杆菌等细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，但丙酮酸不被缩合成乙酰甲基甲醇，培养基中酸多，pH值低，故呈红色，为阳性。而产气杆菌将丙酮酸缩合成乙酰甲基甲醇，培养基中酸少，pH值高，故呈黄色，为阴性。

注：甲基红试剂：取甲基红0.04 g，溶于60%的酒精100 ml中。该试剂酸性时呈红色，碱性时呈黄色。

（3） V-P试验(Voges-Proskauer test)

将细菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，37℃培养48h后，再向培养基中加入等量的40%氢氧化钾溶液(含有0.3%肌酸)。产气杆菌分解葡萄糖生成丙酮酸，丙酮酸又被缩合成乙酰甲基甲醇，后者遇碱被空气中氧氧化，生成二乙酰，二乙酰又和培养基中的胍基化合物发生反应，生成红色化合物，培养基变红色，是为V-P试验阳性，其他细菌不能生成乙酰甲基甲醇，培养基不变色，为阴性。

（4） 枸橼酸盐利用试验(Utilization of citrate)

将细菌接种于枸橼酸盐培养基上，37℃培养48 h。产气杆菌等细菌能利用枸橼酸盐作为碳源，分解枸橼酸盐生成碳酸盐，使培养基变为碱性，培养基中的指示剂由淡绿色转为深蓝色，为枸橼酸盐利用试验阳性。大肠杆菌则不能分解枸橼酸盐，培养基颜色不变，为阴性。

3.  硫化氢产生试验(Production of H2S)

将细菌穿刺接种于醋酸铅培养基中，37℃培养24 h后观察结果。有些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸，生成硫化氢，穿刺部位呈黑褐色，是为反应阳性。培养基颜色无变化，则为阴性。

4.  尿素分解试验(Splitting of urea)

将细菌接种于尿素培养基中，37℃培养18～24 h。变形杆菌能迅速(2～4 h)分解尿素产生大量的氨，使培养基变碱而呈紫红色，是为阳性反应。

现在多种微量、快速、半自动或全自动的细菌生化反应试剂盒和检测仪器已广泛应用于临床。如SCEPTOR细菌鉴定仪，是一种自动化鉴定系统，包括微生物鉴定和药敏试验两部分，通过24个生化反应和59种抗生素敏感试验，结果自动进入电脑，资料经电脑快速做出判断，结果可靠，操作简便。