细胞抽提物的制备
核糖体及多核糖体的分离
70S核糖体的纯化
多核糖体的纯化
将核糖体解离为大亚基和小亚基
| 实验材料 | 细胞 |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | 弗氏破碎缓冲液 匀浆缓冲液 |
| 仪器、耗材 | 弗氏破碎器 |
| 实验步骤 | 1. 将 5~10 g 新鲜或冻存的细胞沉淀物垂悬于弗氏破碎缓冲液中或者适当的匀浆缓冲液中。通常 4L 的大肠杆菌培养物可以获得大约 7.5 g 的细胞沉淀。 2. 悬液中加入无 RNase 的 DNase 至终浓度为 2 μg/ml 并在 4℃ 中放置 20 分钟。 3. 细胞破碎： (1) 真细菌的 70S 核糖体 弗氏破碎缓冲液： 20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5 50 mmol/L MgOAc 100 mmol/L NH4Cl 1.0 mmol/L DTT 0.5 mmol/L EDTA 细胞在弗氏破碎器中以每平方英寸 16000 磅的压力破碎 1 分钟。 (2) 真细菌多核糖体 弗氏破碎缓冲液： 20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.6 50 mmol/L MgCl2 150 mmol/L NH4CI 细胞在弗氏破碎器中以每平方英寸 13800 磅的压力破碎 1 分钟。 (3) 哺乳动物核糖体 将组织切碎并重悬于两倍体积的匀浆缓冲液： ① 哺乳动物匀浆缓冲液： 50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5 5 mmol/L MgCl2 25 mmol/L KCl 0. 2 mol/L 蔗糖 将悬液在玻璃匀浆器中用一只马达驱动的宽松配置的聚四氟乙烯研杵捣 8~10 下，使之匀浆化。 如果核糖体来自网织红细胞，则重悬于 2 倍体积的网织红细胞匀浆缓冲液。 ② 网织红细抱匀浆缓冲液： 10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5 1.5 mmol/L MgCl2 10 mmol/L KCl 2 mmol/L DTT 用玻璃匀浆器和手持的宽松配置的聚四氟乙稀研杆捣 3 次使悬液匀浆化。 (4) 植物核糖体和多核糖体 将植物组织用 0.1% 的 DEPC 处理过的 H2O 于室温下清洗。将组织在液氮中冷冻后用冷的研钵和研杵捣碎成细的粉末。 将粉末重悬于 2 倍体积冷的植物抽提缓冲液中： 植物抽提缓冲液 50 mmol/L Tris-HCl，pH 9.0 30 mmol/L MgCl2 400 mmol/L KCl 17% 蔗糖 将悬液在一个磨碎器中每隔 1 分钟施加一次 15 秒的脉冲，重复 4 次使之匀浆化将匀浆液先用 2 层 DEPC 处埋过的冷的纱布（Fisher) 过滤，然后再用 8 层纱布过滤。 (5) 叶绿体核糖体 用 dH2O 清洗植物组织（菠菜叶，250 g），然后悬于 250 ml 的叶绿体匀浆缓冲液中： 叶绿体匀浆缓冲液： 100 mmol/L Tris-HCI，pH 7.5 5 mmol/L MgOAc 50 mmol/L KCl 5 mmol/L β-巯基乙醇 0.7 mol/L 蔗糖 将悬液在磨碎器中匀浆处理 45 秒，然后用冷的 DEPC 处理过的纱布过滤。 于 2℃ 以 360 g 离心 5 分钟使抽提物澄清，然后以 1200 g 离心 15 分钟使叶绿体沉淀下来。用叶绿体匀浆缓冲液洗沉淀物然后再离心沉淀。 为了破碎膜并裂解叶绿体，将叶绿体沉淀重悬于含有脱氧胆酸钠（终浓度为 0.5% ) 或 Triton X-100 ( 终浓度为 1.0% ) 的 50 ml 裂解缓冲液中。 叶绿体裂解缓冲液： 100 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5 10 mmol/L MgOAc 50 mmol/L NH4CI 6 mmol/L β-巯基乙醇 4. 用 Sorvall SS-34 转头于 4℃ 离心除去裂解物中的细胞碎片，离心速度和时间如下： (1) 对于原核 70S 核糖体，以 30000 g 离心 30 分钟。 (2) 对于真核多核糖体，以 7700 g 离心 8 分钟，保留上清，用于作多核糖体的纯化步骤。 (3) 对于哺乳动物核糖体，以 20000 g 离心 10 分钟。 (4) 对于植物核糖体和多核糖体，以 1000 g 离心 7 分钟，向上清中加入 0.1 体积的 20% Triton X-100 然后以 16000 g 离心 20 分钟。 (5) 对于植物叶绿体，以 26000 g 离心 20 分钟。 |
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