细菌胞浆内钙离子浓度荧光（Fura-2）检测试剂盒产品说明书（中文版）
主要用途
细菌胞浆内钙离子浓度荧光（Fura-2）检测试剂是一种旨在通过胞浆钙离子特异性荧光探针Fura-2-AM，与钙离子结合后，其荧光强度显著增强，在荧光酶标仪下测量不同激发波长下相对荧光峰值的比值，来测定细菌胞浆总钙离子浓度的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种活体细菌胞浆钙离子的浓度检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，检测敏感。
技术背景
细胞浆钙离子在调节钙离子通道，维持细胞内环境钙离子平衡方面起着重要作用。在细菌中，钙对于细菌的生长和结构具有重要作用。细胞浆钙的检测包括沉淀法、EDTA鳌合滴定法、火焰光度法（flame
photometry）、原子吸收分光光度法等技术，但容易受到钠、钾、磷酸盐、硫酸盐的干扰，或者受限于仪器的特殊的要求，以及需要细胞浆分离。Fura-2
AM（acetoxy-methyl
ester），一种具有细胞膜通透性，与钙离子结合产生荧光的染料，通过其不同激发波长340nm/380nm产生的荧光信号比（散发波长505nm）来精确测定细菌胞浆内钙离子水平。
产品内容
清理液（Reagent A） 40毫升
染色液（Reagent B） 30微升
介导液（Reagent C） 600微升
饱和液（Reagent D） 2毫升
阴性液（Reagent E） 2毫升
产品说明书 1份
保存方式
保存染色液（Reagent B）和介导液（Reagent C）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月
用户自备
1.5毫升离心管：用于样品操作的容器
培养箱：用于染色孵育
100微升1厘米光径比色皿或黑色96孔板：用于荧光分析的容器
荧光酶标仪：用于荧光分析
（共聚焦）荧光显微镜：用于荧光染色观察
实验步骤
样品准备
准备好1毫升待测的细菌样品（1 X 108细菌/毫升0
放进微型台式离心机离心5分钟，速度为3500g
小心抽去上清液
加入1毫升清理液（Reagent A），混匀细菌颗粒群
放进微型台式离心机离心5分钟，速度为3500g
小心抽去上清液
重复实验步骤4至6一次
加入1毫升清理液（Reagent A），混匀细菌颗粒群
放进冰槽里备用
测定准备
设定好荧光酶标仪：激发波长340nm和380nm，散发波长505nm
测定开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent B）室温下融化，然后分别移出30微升介导液（Reagent C）和1.5微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升离心管，标记为染色工作液，并放在暗室里备用。然后进行下列操作。
二、荧光酶标仪检测
准备3个1.5毫升离心管，标记为：细菌样品管、空白对照管（不含细菌）、最大对照管（含细菌）
分别移取100微升上述准备的细菌样品到细菌样品管和最大样品管里
放进微型台式离心机离心5分钟，速度为3500g
小心抽去上清液
加入100微升清理液（Reagent A）到细菌样品管里，混匀细菌颗粒群
加入100微升饱和液（Reagent D）到最大对照管里，混匀细菌颗粒群
加入100微升阴性液（Reagent E）到空白对照管里
分别加入10微升染色工作液到所有管里，混匀
放进37℃细胞培养箱里孵育120分钟，避免光照
转移到100微升1厘米光径比色皿或黑色96孔板里
即刻放进荧光酶标仪测读：获得相对荧光单位（relative fluorescence unit；RFU）包括样品RFU340nm、样品RFU380nm、空白对照孔RFU340nm、空白对照孔RFU380nm、最大对照孔RFU340nm、最大对照孔RFU380nm
计算样品细菌胞浆钙离子浓度
{【（样品RFU340nm/样品RFU380nm）－（空白对照孔RFU340nm/空白对照孔RFU380nm）】÷【（最大对照孔RFU340nm/最大对照孔RFU380nm－样品RFU340nm/样品RFU380nm）】}X（空白对照孔RFU380nm/最大对照孔RFU380nm）
X 315（纳摩尔；解离常数）
三、（共聚焦）或荧光显微镜检测
移取300微升上述准备的细菌样品到1.5毫升离心管
加入30微升染色工作液，混匀
放进37℃细胞培养箱里孵育120分钟，避免光照
放进微型台式离心机离心5分钟，速度为3500g
小心抽去上清液
小心加入500微升清理液（Reagent A），混匀细菌颗粒群
放进微型台式离心机离心5分钟，速度为3500g
小心抽去上清液
小心加入300微升清理液（Reagent A），混匀细菌颗粒群
移取50微升到载玻片上
盖上盖玻片
即刻在（共聚焦）荧光显微镜下进行观察：激发波长340至400nm，散发波长505nm（细菌胞浆钙离子呈现蓝色荧光）
注意事项
本产品为20次（显微镜）或60次（96孔板）操作
操作时，须戴手套
可以使用荧光分光光度仪检测
避免使用EDTA等处理样品
孵育反应完成后即刻进行荧光测定
如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
检测敏感度可达纳摩尔级钙浓度范围