细菌膜蛋白的分离

实验概要

本实验对细菌膜蛋白进行了分离。

主要试剂

1. Tris-Mg 缓冲液
   10mM Tris-Cl
   5mM MgCl₂
   pH 7.3，4℃保存
2. 2%(w/v)十二烷基肌氨酸钠 (SLS)

实验步骤

1. 于20ml 营养肉汤中过夜培养细菌，37℃，200rpm。
2. 10000g、20min、4℃离心，去上清。
3. 20ml预冷的Tris-Mg缓冲液重悬，同样条件离心，再重悬于预冷的Tris-Mg缓冲液。
4. 超声波破碎细菌。
5. 3000g，10min室温下离心去除未破碎细菌。小心吸取上清（含有胞质成分和细菌外被成分）。
6. 超速离心I：100,000g，60min，4℃，去除上清（胞质成分），收集细菌外被成分。
7. 用10ml含2％的SLS的Tris-Mg 缓冲液重悬沉淀物，室温温育20-30min。
8. 超速离心II：70,000g，60min，室温沉淀收集外膜蛋白，去除上清（含细胞质膜）。重复7、8两步。
9. 充分吸除上清，并根据沉淀体积大小用0.1-0.2 ml的ddH₂O重悬沉淀物。根据公式：蛋白浓度(mg/ml)=1.450 D₂₈₀-0.740 D₂₆₀测定外膜蛋白浓度，调节蛋白浓度至40ug/ul，该蛋白质样品-70℃贮存。