结肠直肠肿瘤细胞的培养

用于传代培养的Dispase

生长培养液 洗液 消化液

培养瓶

一、酶消化

1. 用洗液（洗液：添加 5% FBS、200 U/ml 青霉素、200 ug/ml 链霉素和 50 ug/ml 庆大霉素。在原代培养时，庆大霉素的作用至少维持一周，然后除去。）清洗肿瘤标本 4 次。

2. 将组织块放入小量洗液中，洗液恰好浸没组织块（避免组织干）。用交叉的手术刀片或锋利手术剪将组织块剖成约 1 mm³ 小块。

3. 通过用台式离心机离心（300 g，3 min），将组织块清洗 4 次。清洗次数以经验而定，并根据细胞污染情况。

4. 将组织块放入消化液（消化液：DMEM，添加的抗菌素同洗液，并添加 1.5 mg/ml 胶原蛋白酶（ IV型，Worthington）、0.25 mg/ml 透明质酸酶（ I 型，Sigma）和 2.5%~5% FBS。尽管常用 Worthington 公司生产的胶原蛋白酶，也可试用 Sigma 公司生产的培养级别的胶原蛋白酶。），在 37℃ 条件下摇晃，通常过夜（约 12~16 h )。由于消化是一个缓慢过程，组织块在消化液中的时间多少并不要紧，重要的是在此过程中不让消化液变为酸性。低 pH 说明组织块在消化液中的时间过长或放入消化液中的组织块过多。将约 1 cm³ 肿瘤组织放入 20~40 ml 消化液。

二、非酶消化

腺瘤总是需要用酶消化。然而，常发现在用手术刀片将癌组织切成 1 mm³ 、时小的细胞簇从肿瘤组织脱落入洗液中。在这种情况，可按下列步骤操作。

1. 收集含有脱落细胞簇的洗液。

2. 将离心管放置几分钟，通过重力使细胞簇沉降，将组织块与小的细胞簇分开。

3. 吸出上清液。

4. 直接培养剩下组织块，或者将组织块放入洗液内，轻轻摇晃 30~60 min，以便使更多的小细胞簇脱落下来，然后收集细胞簇，种植于培养皿内，与剩余的组织块分开培养。

5. 在种植于培养皿内之前，将所有标本洗 3 次。

三、原代培养的标准条件

1. 在预涂胶原蛋白和种植饲养细胞的 25 cm² 培养瓶，用 4 ml 培养液培养从肿瘤组织分离的上皮性小管和细胞簇。

2. 在含有 5% CO₂ 和 37 ℃ 的培养箱内培养。

3 . 每周换培养液两次。

小管和细胞在 1~2 d 内开始附着底物，上皮细胞迁移出来。大多数小管和小的上皮块在 7 d 内贴壁，但大的类器官物需要 6 周才能贴壁，尽管贴壁时间有所变化。

如果将细胞接种于预涂胶原蛋白的培养瓶（Biocoat，B-D Biosciences），在原代培养过程中上皮容易贴壁。与无 3T3 词养层相比，将细胞接种于 3T3 饲养层上时细胞生长非常好。当上皮细胞克隆扩增至每个克隆有几百个细胞时，它们变得不依赖于 3T3 饲养层，故不必再加入词养层细胞。

四、继代培养和扩增

不能用常规的胰蛋白酶和 EDTA 混合液处理方法对大多数结肠直肠腺瘤的原代细胞和腺瘤细胞系进行传代 [ Paraskeva et al.， 1984，1985 ]。由于用 0.1 % 胰蛋白酶（用 0.25 mmol/L EDTA 配制）将腺瘤细胞分散为单细胞导致细胞生长很差，故换用 Dispase。

1. 将 Dispase 液注于细胞单层上，恰好浸没细胞（每个 25 cm² 培养瓶约 2.5 ml）。对原代细胞处理 40~60 min，而对细胞系处理 20~40 min。

2. 一旦上皮细胞层开始去附着（去附着的是细胞片，而不是单细胞），用吸管吹打，以促进去附着，使细胞片分散成细胞簇。

3. 在标准的培养条件下清洗和种植细胞。几天后细胞簇去附着，故应轻轻换液。