绘制细胞增殖曲线

实验概要

为了掌握细胞的增殖速率，常用的方法有不同时间点细胞数目统计、MTT法绘制增殖曲线等。下面以MTT法为例，简述绘制增殖曲线的方法。

实验原理

活细胞线粒体中的脱氢酶能够还原黄色的MTT为蓝紫色的不溶于水的甲瓉（formazan）,甲瓉的多少可通过酶标仪测定其在490nm处的光密度（Optical Density，OD）值而得知。因为甲瓉生成量在通常情况下与活细胞数成正比，因此可以通过OD值推测活细胞数目，了解药物抑制或杀伤细胞的能力。

主要试剂

DPBS、5mg/mLMTT
待检测的药物根据实验要求设置浓度梯度

主要设备

96孔平底板、酶联免疫监测仪

实验步骤

（1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，在96孔平底板每孔加入100μL细胞悬液，铺板使待测细胞调密度至每孔约1000～10000个细胞，边缘孔用无菌DPBS填充。
（2）5%CO₂、37℃培养箱孵育约12 h，至细胞单层铺满孔底，加入浓度梯度的药物。
（3）5%CO₂、37℃孵育16～48 h，于倒置显微镜下观察细胞密度和细胞形态。
（4）每孔加入20μL5mg/mL MTT溶液，继续培养4～8h。
注意：若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用DPBS冲2～3遍后，再加入含MTT的培养液。
（5）终止培养，小心吸去孔内培养液。
（6）每孔加入150μL DMSO，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。通过酶联免疫检测仪，测量490nm处的吸光值。
（7）用不同的生长时间和吸光值作图，横轴为时间点，纵轴为吸光值。
注意：

1. MTT法只能测定细胞的相对数和相对活力，不能测定细胞的绝对数。
   

2. 用MTT检测时，尽量无菌操作，细菌会对MTT结果产生影响。
   

3. MTT实验结果波动较大，应多设置重复孔，并且做好预实验，优化实验条件，尽可能减小实验结果差异。
   

4. 接种细胞的细胞数和细胞悬液的均匀程度对MTT结果有很大影响。尽量使细胞处于对数期的时候进行检测，并且，初始接种的细胞悬液一定要均匀。