实验方法原理 在标准培养箱（37°C ) 中用 Leighton 塑料管培养细胞，然后用胰蛋白酶悬浮法收集细胞。
实验材料 羊水标本D-PBSA秋水仙酰胺胸腺嘧啶核苷溴脱氧尿核苷胰蛋白酶EDTA Histopaque-l077
试剂、试剂盒 完全培养液胰蛋白酶和EDTA混合液消毒剂如Virkon氯化钾低渗溶液固定液过氧化氢溶液生理盐水胰蛋白酶生理盐水pH6.8的缓冲液Leishman染液
仪器、耗材 普通容器塑料吸管和培养用移液器塑料Leighton管和盖注射器一次性塑料移液吸管或巴斯德吸管显微载玻片Copline缸DPX玻片封固剂和盖玻片烘箱加热板亮视野相差正置显微镜
实验步骤
试管培养的建立和检测
1. 将约 10~15 ml 羊水用普通塑料无菌容器送到实验室。
2. 用带有无菌塑料混合针的 20 ml 无菌注射器或 10 ml 吸管将样本分入 3 个 Leighton 管中。按病入和详细鉴别资料标记试管。如果样本较少（5 ml 或少于 5 ml )，可用 2 个培养管培养。
3. 离心（150 g，5 min )。
4. 将上清液倒回原来的容器，以供生物化学分析或免疫学分析，例如 α-甲胎蛋白（AFP ) 测定，或者将上清液倒入消毒溶液（Virkon )。
5. 在每个 Leighton 管中用 1 ml 培养液将细胞混悬。
6. 在 37°C 条件下培养 Leighton 管内的细胞。
7. 将细胞静止培养 5~7 天，使细胞贴壁和建立克隆。
8. 评估细胞生长情况。根据细胞的生长程度，添加 0.5 ml 新鲜培养液或除去培养液后加入约 1 ml 新鲜培养液。
9. 此后，按需要每 2~4 天重新评价细胞的生长状况，适当更换培养液，直至有足够细胞收集。通常在培养后 7~12 天收集细胞。如果有可能，在收集细胞的前一天更换培养液。
分散和传代
10. 将每个培养管加入约 1.5 ml 灭菌的 TE 液，预温至 37°C 。
11. 从培养管中弃去培养液，然后用 1 ml 灭菌的 TE 液浸洗 1 次。
12. 分散细胞
(a)将 0.2 ml TE 液加入培养管，在 37°C 条件下孵育 1~2 min，使细胞脱落。
(b)用倒置显微镜检査细胞。当细胞悬浮时，加入 1 ml 培养液，然后将培养管放回培养箱。培养液中的血清可终止 TE 液的作用。
13. 传代
(a)将 0.5 ml TE 液加入培养管，在 37°C 条件下孵育 1~2 min，使细胞脱落。
(b)用倒置显微镜检查细胞。当细胞悬浮时，加入 1.2 ml 培养液，然后将细胞悬液分放入合适数目的继代培养管。可接种 2~8 个培养管，这取决于最初的细胞密度。使每个传代培养管中的细胞密度不等，通常是有价值的。这样，能够有机会以最佳细胞密度收集培养管内的细胞。
(c)在每个传代培养管加入新鲜培养液至 1 ml，然后培养。
14. 第 2 天确认细胞已贴壁，然后更换培养液。
培养管内细胞的常规收集
只要备有其他培养细胞，可在原代细胞进行常规收集。如果只保留 1 个培养管，应在收集细胞前继代培养，或在收集后将细胞传代。
15. 当准备收集细胞时，将 0.1 ml 稀释过的秋水仙酰胺（将 1 ml 秋水仙胺酰加人到 9 ml 无菌 D-PBSA 中，作为工作液。然后，每 1 ml 细胞培养液中加入 0.1 ml 工作液，终浓度达到 0.1 μg/ml）加入到每个培养管中。
16. 有必要将细胞培养足够的时间，以便获得较多呈圆形的有丝分裂细胞。典型的培养时间为 2~3 h ，但很活跃的细胞可少至半小时，缓慢生长的细胞可达 4 h 以上。
17. 将培养液移入 Virkon 溶液，再将培养管在纸巾上倾流片刻。
18. 加入 2 ml TE 液后，在 37°C 条件下将细胞培养 3 min，以便使细胞脱落。
19. 当细胞悬浮时，加入 7 ml 氯化钾低渗溶液（0.075 mol/L KCl，用 UPW 配制。将 5.574 g Analair 氯化钾加入 1 L 超纯水中
），在 37°C 条件下将细胞放置 5 min。
20. 离心（150 g，5 min )。
21. 小心地将上清液倒入 Virkon 溶液中，然后将培养管在纸巾上倾流片刻。轻弹培养管，使细胞在剩余的少量培养液中悬浮。
22. 用新鲜固定液（新鲜配制，将 3 份 Analar 甲醇和 1 份 Analar 冰乙酸混合）缓慢固定细胞
(a)轻弹培养管后，滴入 1~2 ml 固定液。不断摇晃细胞，以免细胞成簇。
(b)加入 3~4 ml 固定液。
23. 离心（150 g，5 min )。
24. 将上清固定液倒入碳酸氢钠溶液中。
25. 轻轻混悬细胞后，加入 5 ml 固定液。
26. 通过离心、倒掉上清固定液和再固定，更换固定液，即重复操作步骤 9~11。
27. 将细胞离心后，倒掉上清液，用剩余的固定液混悬细胞，制备细胞涂片 (见后述的玻片制备步骤）。